恒磁场对金属离子钴铬作用下人单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响
作者：戴闽，熊建卫，詹 平，漆启华，郝亮
【摘要】 [目的]探讨恒磁场对金属离子钴、铬作用下人外周血单核细胞分泌肿瘤坏死因子的影响，寻找防治假体周围骨溶解的方法。[方法]将CoCl2粉末与CrCl3粉末溶于无菌注射用水配制成CoCl2溶液和CrCl3溶液，从健康人外周血提取单核细胞，将金属离子Co2+、Cr3+分别与人单核细胞在不同的磁场强度(1 mT、10 mT、100 mT)下共培养。实验分9组：单核细胞组(对照组)、Co2+、Cr3+组、Co2+、Cr3+分别+不同磁场强度(1 mT、10 mT、100 mT)组，各组细胞于培养12、24、48 h取细胞上清液，用ELISA法检测上清液中肿瘤坏死因子(TNF-α)的含量，以吸光度(A值)的高低来反映标本中肿瘤坏死因子α含量的多少。[结果]Co2+、Cr3+均能刺激人单核细胞释放TNF-α(P< 0. 05)，且以24 h释放最为明显。经磁场暴露12 h之后，1 mT、10 mT、100 mT磁场处理组TNF-α量均低于非磁场处理组(P< 0. 05)，并呈现强度依赖性。[结论]一定强度的恒磁场可拮抗金属离子钴、铬刺激人外周血单核细胞分泌TNF-α，为磁场疗法防治假体周围骨溶解提供了理论依据。
【关键词】 恒磁场; 肿瘤坏死因子; 金属离子; 无菌性松动
Abstract: [Objective]To detect the effect of constant magnetic field on metal ion Co2+,Cr3+ induced TNF-α secreted by human mononuclear cells, and to search a method for prevention and treatment of aseptic loosening. [Methods]CoCl2 powder and CrCl3 powder were dissolved in the asepsis injecting water. Mononuclear cells from human peripheral blood, were taken and cultured with Co2+,Cr3+ ions in different magnetic field of 10Gs,100 Gs,1000Gs for 12,24 and 48 hs. There were nine groups: control group,Co2+ group,Cr3+ group,Co2+andCr3+ with various intensities of constant magnetic field,respectively.ELISA method was applied to detect tumor necrosis factor (TNF-α) in serum via the absorbance (A).[Results]Co2+ and Cr3+ ions stimulated human mononuclear cell to secrete TNF-α (P<0. 05). TNF-α content was obviously higher at 24 h.After the magnetic exposure time extended to 12 h, TNF-α value obviously decreased (P<0. 05) as compared with non-magnetic group,and it was positively related to the Aintensities of constant magnetic field.[Conclusion]Within a certain range of magnetic intensity , constant magnetic fields inhibit human mononuclear cell stimulated by Co2+andCr3+ ions to secrete TNF-α.It provides a theoretical basis for the prevention and treatment of aseptic loosening.
Key words：constant magnetic field; tumor necrosis factor; metal ion; aseptic loosening
人工关节置换术是骨关节疾患的有效方法之一。但随着人工关节使用年限的延长，人工关节无菌性松动这一问题逐渐凸现出来，磨损产物导致的骨溶解是人工关节中晚期失败的主要原因。目前研究认为，人工关节磨损产物能刺激单核巨噬细胞释放肿瘤坏死因子、白细胞介素1、白细胞介素6等炎症介质，这些溶骨性因子能诱使破骨细胞的成熟、活化，产生骨溶解，最终导致人工关节无菌性松动。其中TNF-α能够通过多种途径参与破骨细胞的分化及生物活性的调控，在骨溶解这一病理过程中扮演了非常重要的角色。
磁场是骨科领域治疗骨不连、促进骨愈合的重要生物物理手段，对骨代谢、骨重建具有重要调节作用，并且磁场具有无创性、无副作用和无药物之间相互作用等优点，具有广阔的临床应用前景[1]。同时，有研究报道磁场具有抗炎抗氧化作用，它能通过抑制炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β等的产生，从而缓解大量TNF-α堆积造成的炎症反应及病理损伤，达到治疗疾病的目的[2]。恒磁场是否对磨损产物诱导的炎症因子的产生具有影响，目前国内外尚未见报道，本实验以金属离子刺激单核细胞为模型，观察不同强度恒磁场对其分泌TNF-α的影响，以期为预防和治疗无菌性松动提供一种新的方法。
1 材料与方法
1.1 恒磁场的设计
实验中采用的恒定磁场为稀土钕铁硼永磁体，由深圳市怡天磁性材料有限公司加工设计，由两块钕铁硼磁体制成为15 cm×10 cm×3 cm长方体，4周用软铁进行磁屏蔽，充磁后使之空间磁场强度分别恒为1、10、100 mT，细胞培养时培养板可以直接置于磁体中一同放入培养箱中。
1.2 主要试剂及仪器
CoCl2粉末与CrCl3粉末(均购于南康化学仪器公司)，环氧乙烷消毒后溶于无菌注射用水配制成CoCl2溶液和CrCl3溶液，使用前内毒素鳌试剂检测均证实无内毒素，肿瘤坏死因子ELISA试剂盒(晶美生物公司)，小牛血清(特级，杭州四季青)，酶标分析仪RT-2 100 C(深圳雷杜公司)。
1.3 单核/巨噬细胞的提取与培养
从12名健康志愿者分别抽取50 ml外周血，用Lymphoflot和Percoll梯度离心获得外周血中的单核细胞，细胞记数。将细胞在35 mm培养皿中培养(培养液：RPMI 1 640+体积分数10%胎牛血清+质量分数1%青霉素、链霉素+2 mmol/L左旋谷氨酰胺)，4×106个/孔。在温度37℃，体积分数5%二氧化碳的培养箱中培养30 min，使细胞贴壁，在显微镜下观察，见细胞的贴壁率98%，洗去未贴壁的细胞，重新加入培养液后将细胞置入培养箱中培养过夜使其分化。
1.4 金属离子与单核细胞在不同磁场强度下共培养
在加入金属离子前，酞酚蓝检测培养皿中单核细胞活性>98%。在单核细胞悬液中分别加入CoCl2 溶液使其终末溶度为10-5、加入CrCl3溶液使其终末溶度为5×10-4。本实验将钴、铬离子与单核细胞共作用后进行不同磁场强度恒磁场的加载处理，设单核细胞培养组(对照组)、Co2+、Cr3+组和Co2+、Cr3+分别+1、10、100 mT组，分别于作用12、24、48 h取细胞培养上清液，用ELISA 试剂盒检测TNF-α含量。
1.5 统计学分析
实验所得数据采用SPSS 13.0软件中的单因素多组资料的方差分析，数据用x-±s表示，用F检验(方差不齐时采用F′验)，P< 0. 05为差异有显著性意义。
2 结果
2.1 Co2+刺激下各组单核细胞(PBMC)分泌肿瘤坏死因子结果见表1 表1 Co2+刺激下各组肿瘤坏死因子分泌结果
ELISIA测得的OD值与标本中TNF-α的含量呈正比，因此以所测的OD值的高低来反映标本中TNF-α含量的多少。如表1中示钴离子与单核细胞共培养12、24、48 h后，测得TNF-α含量均高于对照组(P< 0. 05)，且24 h实验组作用最为明显。由图1可见，与钴离子组比较，各磁场组在加载12 h后，结果显示各磁场组对TNF-α分泌的抑制作用不明显(P>0. 05)，经磁场作用24、48 h后，1、10、100 mT磁场处理组TNF-α量均低于钴离子组，与钴离子组比较，差别有统计学意义(P< 0. 05)，并呈现强度依赖性。
2.2 Cr3+刺激下各组单核细胞(PBMC)分泌肿瘤坏死因子结果见表2 表2 Cr3+刺激下各组肿瘤坏死因子分泌结果
与钴离子类似，经铬离子刺激12、24、48 h后，单核细胞分泌的TNF-α含量均高于对照组(P< 0. 05)，TNF-α水平于24 h达峰值。如图2所示，与铬离子组比较，经磁场作用24、48 h后，1、10、100 mT磁场处理组TNF-α量经统计学分析均低于铬离子组(P< 0. 05)，并呈现强度依赖性，而恒磁场作用12 h时，结果显示各磁场组对TNF-α分泌的抑制作用不明显(P>0. 05) 。
3 讨论
假体周围骨溶解造成的无菌性松动是导致人工关节使用寿命较短的主要原因。国内外一直致力于探索人工关节术后骨溶解松动的机理及寻找对策，现在已从细胞分子学水平揭示磨损产物可诱导假体周围组织细胞产生一系列生物学反应直接或间接激活破骨细胞，导致假体周围骨溶解的机理。金属对金属髋关节假体有着较高的抗疲劳强度和优越的耐磨性，且金属磨损颗粒引起的组织反应和骨溶解明显低于聚乙烯磨损颗粒，临床应用日益广泛。金属假体在使用过程中，除产生大量的金属颗粒外，还能产生大量金属离子，其中以金属钴、铬为主。当金属离子浓度升高到一定程度后，能通过多种途径诱导假体周围骨溶解，最终导致假体的无菌性松动[3]。本实验中，金属离子钴、铬与单核细胞共同培养12、24、48 h后，TNF-α水平均较对照组有明显升高，证实了金属离子钴、铬可以刺激人外周血单核细胞，引发溶骨性因子TNF-α的释放，从而活化更多破骨细胞，诱发假体周围骨溶解，引起假体松动。
关节的磨损产物可以刺激单核巨噬细胞生成大量溶骨性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等，这其中TNF-α被视为引起骨吸收最重要的炎性细胞因子[4]。在磨损产物诱导的无菌性松动中，TNF-α既可通过诱导成骨细胞表达M-CSF和RANKL，间接促进破骨细胞的成熟和分化;也可直接促进已与RANKL作用过的前体细胞分化为破骨细胞，激活成熟的破骨细胞并抑制其凋亡;同时，它还能刺激炎性细胞分泌IL-1和IL-6，而这两者又能引起巨噬细胞和破骨细胞的趋化作用，向界膜内聚集，从而引发骨溶解[5]。此外，TNF-α还可明显降低成骨细胞活性，刺激其凋亡，并能抑制成骨细胞合成I型胶原，抑制成骨细胞碱性磷酸酶生成，减少细胞内钙含量，从而抑制骨形成和钙化[6]。因而，TNF-α在无菌性松动机制及防治的研究中有着不可替代的作用。 图1不同磁场强度对Co2+刺激下单核细胞分泌TNF-α的影响
图2不同磁场强度对Cr3+刺激下单核细胞分泌TNF-α的影响
随着人们对无菌性松动研究的深入，其发病的主要机理已逐渐被人们所认识。那么，如何对骨溶解的进程及危害程度进行防治则是目前凾待解决的问题。目前，在减少假体机械磨损方面，人们不断选择更低磨损的假体材料，改进其加工工艺，减少假体植入后对骨组织的应力遮挡，同时改进外科操作技术更加注重假体的选择及安装，尽可能有效地延缓松动的发生。在药物防治研究领域，Pollice等[7]实验表明己酮可可碱能抑制人外周血单核细胞释放TNF-α，提示己酮可可碱对于治疗人工关节无菌性松动可能有一定的作用;二膦酸盐已经证实可以直接抑制破骨细胞，调节炎性因子TNF-α的生成，调节RANKL/OPG的比例， 从而抑制破骨细胞的分化、成熟及增殖，最终达到预防磨损颗粒诱发人工关节假体周围骨溶解的作用[8];另研究报道红霉素、环氧化酶抑制剂、他汀类药物及PDTC等均可不同程度的抑制骨溶解的发生[9、11]。此外，基因治疗作为近年来兴起的一种治疗方法，可在分子水平进行调控，主要利用腺相关病毒载体、逆转录病毒载体和自杀基因三种方式在假体无菌性松动的病理过程中进行干预，为防治假体无菌性松动提供了一种[12]。
磁场作为一种非侵入性疗法，其生物学效应研究越来越受到人们的重视。磁场在促进成骨、骨组织再生和骨折愈合等方面取得了一定的研究，其疗效已被国内外专家学者肯定。磁场作用于人体可引起一系列生物学反应，如降低血液粘度、改善微循环、加速创伤愈合、抗炎抗氧化等作用，国内外有不少磁场治疗炎症性疾病的报道。Chang K等[2]研究认为磁场可以修复延迟愈合骨折，具有抑制细胞因子如TNF-α、IL-1β的产生和降低T细胞增殖等作用。于兰等[13]在研究钕铁硼磁场对细胞的生物学效应时发现，恒磁场能显著下调人外周血单核细胞产生的TNF-α。但Salerno S等[14]研究恒磁场对外周血单核细胞释放炎性因子时发现，磁场对于TNF-α、IL-6、IL-10的释放并没有影响。各实验结果的差异可能与磁场类型、强度及作用时间等有关。此外，研究证实恒磁场还可以通过调节骨形态发生蛋白(BMP)、转化生长因子(TGF-β)、Ⅰ型胶原及碱性磷酸酶活性来调节成骨细胞的成熟、分化，对骨组织的代谢、重建具有重要的调节作用[15]。基于磁场的上述作用，作者将其引入人工关节无菌性松动的治疗。本实验中观察到经恒磁场作用12 h后，各组TNF-α水平较不加磁场组无明显差异，说明磁场作用可能具有一定的时间窗口效应，经磁场作用24、48 h，各磁场组对于TNF-α释放的抑制作用明显，并且具有强度依赖性。
通过实验，作者发现一定强度的恒磁场对金属离子所诱导的单核细胞的炎症反应具有负性调节作用，能抑制TNF-α的释放，这不仅丰富了作者对磁场作用的认识， 也为临床上应用磁场防治关节置换术后的无菌性松动提供了有益的参考。当然，对于恒磁场抑制炎性反应的机制，目前还不得而知，
作者还需要做进一步验证和较长时间的观察，包括最佳的磁场作用时间、强度及运用磁场治疗的生物安全性和有效性等。
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