多孔明胶微球/磷酸钙骨水泥的制备及其性能研究
作者：厉孟，刘旭东，刘兴炎，葛宝丰
【摘要】 [目的]制备多孔明胶微球/磷酸钙骨水泥，并于体内体外研究其各种性能。[方法]双相乳化冷凝聚合法制备明胶微球，以不同比例与磷酸钙骨水泥复合(0%，2.5%，5%)，制备多孔磷酸钙骨水泥，测定材料孔径率及抗压强度，筛选出最佳比例。消化法培养成骨细胞接种于常规及多孔磷酸钙骨水泥支架上，扫描电镜观察细胞形态;不同材料浸提液(0%，2.5%明胶微球/磷酸钙骨水泥及聚苯乙烯)分别与成骨细胞共培养，以MTT法测定细胞增殖率，试剂盒检测碱性磷酸酶水平。将磷酸钙骨水泥及2.5%明胶微球/磷酸钙骨水泥分别植入山羊椎体内,6个月后收集标本，分别进行X线影像学及组织学观察，评估其降解情况。[结果]不同比例明胶微球/磷酸钙骨水泥的总孔径率、大孔率及抗压强度分别为：38.7%、0%、12.1 MPa(0%);67.5%、40.6%、8.0 MPa(2.5%);72.2%、45.6%、5.0 MPa(5%)。成骨细胞在明胶微球/磷酸钙骨水泥上生长良好，细胞增殖及碱性磷酸酶水平均明显高于单纯磷酸钙骨水泥组，与聚苯乙烯组未见明显差异。多孔明胶微球/磷酸钙骨水泥6个月后在体内大部分已降解，而磷酸钙骨水泥未见明显降解。[结论]复合明胶微球可显著提高磷酸钙骨水泥的孔径率促进其降解，增加其生物活性，这种多孔磷酸钙骨水泥可作为非负重部位的骨替代物。
【关键词】 多孔磷酸钙骨水泥; 明胶微球; 孔径率; 抗压强度; 骨替代物
Abstract: [Objective]To develop macroporous calcium phosphate cements(CPCs) by incorporating the gelatin microspheres(GMs) and to evaluate the performance of the composite as a bone substitute in vitro and in vivo. [Methods]GMs were prepared by improved emulsified cold-condensation method and macroporous CPCs were developed using GMs with three different weight ratios (0%,2.5% and 5%). The porosity and the compression strength of the three composites were measured to determine the proper weight ratio of GMs. The morphologic changes of osteoblasts were examined with scanning electron microscope at two days after the cells were seeded on the CPCs and GMs/CPCs. The cells were also cultured with different leaching liquor of three kinds of materials (0%, 2.5% GMs/CPCs and polystyrene).Cell viability analysis was performed by MTT assay, and alkaline phosphatase was measured with alkaline phosphatase kit. At six months after implanted in the goat vertebre , the samples with CPCs or GMs/CPCs were obtained and evaluated by X-ray image and histological anatomy.[Results]Porosity of the GMs/CPCs increased with the increase of GMs, but compression strength decreased. The proliferation and differentiation of the osteoblasts were enhanced with the 2.5% GMs/CPCs compared to the CPCs. In vivo study showed that the degradation of GMs/CPCs was improved.[Conclusion]Macroporous calcium phosphate cements can be developed by incorporating gelatin microspheres, and biocompatibility and degradability of the composite can be enhanced. The composite can be used as a bone substitute under non-loaded circumstances.
Key words：calcium phosphate cements; gelatin microsphere; porosity; compressive strength; bone substitute
随着各种创伤造成的骨缺损病例日益增加，对修复材料的需求也与日俱增。自体骨被奉为修复骨缺损的金标准，但来源有限，异体骨效果也较好，但存在伦理及疾病传播的问题。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cements, CPCs)作为新型的骨修复材料，具有可注射、塑形好、骨传导性强等优点，但较慢的吸收率阻碍了其广泛应用;增加孔径率可明显加速CPCs的吸收，是目前CPCs改性研究的热点 [1、2]。本研究通过复合明胶微球(gelatin microspheres, GMs)来制备多孔CPCs，并对其体外生物活性及体内降解率进行了一系列的研究。
1 材料及方法
1.1 主要设备与试剂
78HW-1型恒温磁力搅拌器(杭州仪表电机厂);LGJ冷冻干燥机(军事医学院实验仪器厂);医用离心机(北京仪器厂);IX70倒置显微镜(日本Olympas公司);超速离心机(美国Beckman公司);BI-90粒径分析仪(美国Brookhaven公司);550型酶联免疫仪(美国Bio-Rad公司);万能材料试验机(AG-2000G, 日本Shimadzu 公司);扫描电镜(JSM-5600，日本Jeol公司)。CPCs(上海瑞邦公司);明胶(B型,美国Sigma公司);乳化剂(Span-80、Tween-80，美国Sigma公司);MTT、DMSO(美国Sigma公司);DMEM培养液(美国Gibeco公司);胎牛血清(兰州民海生物);钙黄绿素-AM及碘化苯啶(日本Dojindo公司);碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成);其他化学试剂均为西安化学试剂厂产品。
1.2 GMs及GMs/CPCs的制备
以改进的双相乳化冷凝聚合法制备明胶微球[3]：15%明胶溶液5 ml及液体石蜡油25 ml均预热至50℃，石蜡油中加入0.15 ml Span-80，明胶溶液缓慢加入石蜡油中，800 r/min，离心半径5 cm搅拌10 min，搅拌后混合物骤冷至4℃，得到空白明胶微球，混合物与清洗液(含4℃ 5 g/L Tween-80的PBS液)以1∶1比例置于分液漏斗，清洗3次，去除石蜡油，低温冻干后一次得到空白明胶微球约700 mg。将微球粘于导电胶带上，喷金后在电镜下观察。
分别以重量比为0%，2.5%，5%的比例将明胶微球与磷酸钙骨水泥粉末充分混合，固液比2.5∶1进行固化，反应物注入直径5 mm，高10 mm的不锈钢圆柱体模具，模具于37℃的生理盐水中浸泡7 d，脱模，精确测定材料体积及重量，以下列公式材料总孔径率(PTORAL)及大孔率(PMACRO)：(1) PTORAL=(dHA- dMEASURED)/dHA;(2) PMACRO= 1-dMEASURED/dCPC;其中dHA为羟磷灰石的密度(3.14 g/cm3)，dMEASURED为实验样品的密度，dCPC为磷酸钙骨水泥的密度。脱模样品进行生物力学压缩实验，断裂后的样品表面喷金以扫描电镜观察。
1.3 材料体外细胞实验
CPCs及2.5% GMs/CPCs支架分别浸于10 ml含10%胎牛血清的DMEM中，浸提24 h后离心取上清液，保存于4℃备用，24孔培养板获得的浸提液作为对照组(聚苯乙烯组)。消化法培养大鼠成骨细胞，1代或2代细胞用于实验。细胞以1×103个/ml接种于实验材料表面，培养2 d后以PBS清洗3次，3%戊二醛固定，酒精梯度脱水，喷金后扫描电镜观察。以1×103个/ml的密度接种细胞于96 孔培养板，每孔加入100 μl，在37℃、5%CO2孵箱内培养24 h后，加入不同材料浸提液100 μl进行培养，2 d后进行MTT试验，加入MTT 20 μL，4 h后加入DMSO 150 μL，振荡，酶联免疫检测仪在490 nm波长测定吸光度(optical density，OD)。将细胞以1×104个/m1的密度接种于24孔板， 24 h后换用不同材料浸提液300 μl，培养6 d后加入β-磷酸甘油(10 mmol/l)，维生素C(50 μg/ml)，地塞米松(10-5mmol/l)进行诱导，继续用浸提液培养1周，以试剂盒测定各组碱性磷酸酶(ALP)水平。
1.4 材料体内实验
成年雌性山羊6只，由兰州生物制品研究所实验动物中心提供，体重为(16±2.1)Kg;动物分成两组，分别植入大小为5 mm×10 mm×10 mm的CPCs或2.5%GMs/CPCs。右侧卧位固定，脊柱侧方T10椎体至尾骨部脱毛，碘伏消毒，铺无菌手术单。取腹外侧切口，经皮肤、皮下，分开肌肉，于腹膜外暴露腰椎，在L2及L4椎体侧方去除5 mm×10 mm大小骨皮质，以刮匙在椎体骨松质内制备约5 mm×10 mm×10 mm大小骨缺损，止血完善后植入制备好的材料。术后6个月处死，收集手术椎体标本。标本行X线影像学检查后，经10%福尔马林固定，常规脱钙石蜡包埋，经材料横断面切片，HE染色，光镜下观察。
1.5 统计学分析
数据以均数±标准差表示，SPSS 13.0进行统计分析;采用AVONA方法，SNK-q检验进行两两比较，P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 GMs的形态及粒径
制备的明胶微球粒径约45±30 μm左右，大小均匀，呈规则圆形，微球之间粘连少，分散性好(图1)。
2.2 GMs/CPCs的孔径率及强度
传统CPCs只具有小于10 μm的微孔，无10 μm以上的大孔，GMs/CPCs经浸泡后，微球溶解析出，材料孔径率明显增加，同时出现大量大孔，随着加入微球的增加，孔径率及大孔率均增加(表1)。材料样品表面电镜扫描亦可见CPCs孔径率低，几乎未见大孔，而GMs/CPCs断面孔径明显增多，出现大量较规则的圆形大孔，且随微球量的增加，大孔也增多(图2a～c)。
在抗压强度上，CPCs较高(12±1.1MPa)，2.5%GMs/CPCs组稍低(8±0.7MPa)，5%GMs/CPCs组最低(5±0.4MPa)，各组间有明显差异(P<0.05)。
2.3 材料的细胞生物活性检测
成骨细胞在2.5%GMs/CPCs及CPCs支架上均生长良好，但在2.5%GMs/CPCs上细胞数量较多，且可见部分细胞长入材料孔隙中(图3)。同时，GMs/CPCs组细胞增殖及ALP水平明显高于单纯CPCs组，与聚苯乙烯组相比未见明显差异(表2)。表1 不同磷酸钙骨水泥材料的孔径率表2 成骨细胞在不同材料浸提液中的增殖及分化情况
2.4 材料体内降解实验
6个月后，在X线下可见GMs/CPCs组材料已大部分降解，材料的高密度影已变得较为模糊，植入材料失去完整的形态;CPCs组仍可见清晰且较完整的材料高密度影，只有边缘可见材料影像变得稍模糊(图4)。HE组织切片显示：GMs/CPCs组材料已大部分降解，大量骨组织长入材料，剩余材料被分隔成小块;而CPCs组仍可见大块较完整的材料，材料内部未见任何骨组织长入(图5)。 图1明胶微球 图2不同比例明胶微球/磷酸钙骨水泥电镜下形态 图2a0%明胶微球 图2b2.5%%明胶微球 图2c5%明胶微球
3 讨论
本研究通过在磷酸钙骨水泥中加入明胶微球，利用明胶在模拟的体内环境下可溶解析出，形成微孔结构，成功制备了多孔的磷酸钙骨水泥。明胶微球的加入不仅增强了材料的细胞生物活性，同时加速了材料在体内的降解。
磷酸钙骨水泥良好的生物相容性使其成为组织工程骨的优良材料，但是，磷酸钙骨水泥在体内降解极慢，三维CT显示在椎体内，经12个月其降解率约2%左右，缓慢的降解率严重阻碍了进一步骨替代的完成，这是制约其在临床上大量应用的最大瓶颈[4]。磷酸钙骨水泥的降解主要通过自身溶解与细胞吞噬(破骨及多核细胞)，其中细胞吞噬发生在材料与细胞的接触面，是最主要的吸收方式，故通过增加材料的孔径率，可以扩大材料与细胞的接触面，从而明显加速材料的吸收。[1、2]传统的磷酸钙骨水泥孔径率约38%左右，且无10 μm以上的大孔，细胞无法长入材料内部，降解只发生在材料的外层;而在孔径率为75%，大孔率为49%左右的改良磷酸钙骨水泥材料中，12周后可发现约有65%的材料已降解，同时可见大量新生骨长入取代降解的材料。[2]另一方面，材料的孔径大小及孔径连通性也影响到降解的速度，细胞在 50 μm以上的孔径中才能生长，小的孔径细胞虽然不能长入，但是可以加强孔与孔之间的连接，故也是必不可少的[1、2]。作者通过加入微球的比例及大小控制材料的孔径，2.5%及5%的微球比例，就可使材料具有较高的孔径率。明胶微球的孔径平均在45 μm左右，加入固化液时，微球会进一步膨胀，使材料的孔径大小可完全满足细胞长入的需要。在电镜照片中，可见细胞已长入材料孔隙中。材料的多孔结构也促进了骨组织长入材料内部，从而增加了材料与体内破骨及多核细胞的接触面，加速材料的降解。体内的实验证明在6个月后多孔材料已大部分降解，但无多孔结构的传统磷酸钙骨水泥由于降解只发生在材料周边与组织相接触的部位，故仍可见大部分材料未降解。
磷酸钙骨水泥的孔径率与强度是一对矛盾，目前已报道了多种致孔方法，但仍没有一个较为完美的解决方案。复合可溶的蔗糖或甘露醇是运用最多的方法，加入致孔剂如碳酸氢钠等也是近年来较流行的方法，但这些方法制备的多孔材料强度极低，加入致孔剂还存在孔径大小不易控制及使较多气体进入体内的缺点[2、5、6]。添加可降解物质，特别是高分子聚合物的微球，是较新的方法，运用最多的是掺入PLGA微球，通过微球的逐渐降解，使材料产生微孔结构;PLGA生物相容性较好，微球大小可控，可以携载因子起到长期缓释作用，同时这种结构的多孔磷酸钙骨水泥生物力学强度较前几种有所增强，但其强度仍较弱，而且由于PLGA降解需40 d以上，故孔径形成时间长，新骨长入复合材料较慢[1、7、8]。明胶微球也具有降解及缓释性能，已有报道运用交联的明胶微球制作多孔磷酸钙骨水泥，但孔径率欠理想，其原因在于微球交联率太高，降解很慢，影响了材料的孔径生成[9]。在本实验中运用未经交联的明胶微球，利用其在高于30℃时能溶解的特性，使制备的复合材料在模拟体内环境下形成高孔径率，且孔径较均匀，在同等的孔径率条件下，其强度较以前报道的复合多孔材料有所增强。这主要由于明胶与磷酸钙骨水泥混合固化时，复合体pH值的变化使明胶中大量的羧酸根暴露，与钙及磷离子相互作用，形成复杂的带电荷大分子，导致明胶成为羟磷灰石结晶体位点基质，加速羟磷灰石的转化，结果其排列更加紧密有序[10]。Bigi及Shie等以明胶溶液与磷酸三钙混合，制成明胶/磷酸钙骨水泥，也发现明胶可增强骨水泥的生物力学性能，但对于其最佳比例，Bigi等认为在20%的范围内，比例越高，增强作用越大。Shie等发现2%是较合适的比例，而直接将明胶颗粒与磷酸钙骨水泥混合的实验却表明5%是最佳比例[10～12]。作者的实验发现以微球与粉末混合制备的磷酸钙骨水泥，2.5%的比例是较为可取的，可见复合方法的差异及骨水泥的种类，均可能影响到材料的最佳配比，故具体的比例需按复合材料的具体制作而进行实验确定。另外，虽然这种复合材料的强度有所改善，但仍远低于皮质骨强度，无法应用于负重部位。
明胶是骨的主要有机成分——胶原的降解产物，且无免疫原性，明胶微球与PLGA微球相比，生物相容性更好。明胶微球/磷酸钙骨水泥在体液环境中时，微球溶化成液体，明胶溶液由于浓度差，会以液体状态缓慢析出，使整个支架被明胶包裹，相当于在支架上增加了明胶涂层，这个涂层可明显增加支架材料的细胞活性。作者的细胞实验证明明胶微球/磷酸钙骨水泥具有较好的细胞活性，成骨细胞在复合材料支架上生长良好，细胞的分化和增殖功能均较单纯磷酸钙骨水泥增强。Bigi等[13]的研究也表明加入明胶不仅增强了正常成骨细胞的增殖分化功能，而且骨质疏松症来源的成骨细胞其增殖分化功能也得到了加强。
本实验表明加入明胶微球是制备多孔磷酸钙骨水泥的可行方法，而且得到的复合材料孔径率高，细胞活性好，体内降解较快，强度较以前多孔材料有一定的改善，可作为良好的非负重部位骨替代材料。
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