双相陶瓷生物活性骨的制备及其细胞相容性研究

          作者：彭吾训，王蕾，李彦林，修晓光，赵宏斌，龚跃昆，赵学凌，李世和，胡蕴玉

【摘要】  ［目的］制备一种双相陶瓷生物活性骨，并了解其细胞相容性。［方法］ 分离培养兔骨髓基质干细胞(mesenchymalstemcells， MSCs)，将浓度为1×106／ml的第3代MSCs接种于复合有I型胶原、骨形态发生蛋白(bone morphogenetk protein，BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)的双相陶瓷生物骨(bniphask ceramic bioiogic bone，BCBB)上，联合培养，用倒置相差显微镜、扫描显微镜观察，测定光密度（OD）值，了解双相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF的细胞相容性。［结果］BCBB孔内充满I型胶原、BMP及bFGF。MSCs在双相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF上黏附生长，第6 d时细胞在材料表面形成致密细胞层，增殖达稳定状态。［结论］该研究制备的双相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF具有良好的细胞相容性。

【关键词】  双相陶瓷生物骨； 骨形态发生蛋白； 碱性成纤维细胞生长因子； 骨髓基质干细胞； 生物相容性

    Abstract: ［Objective］To prepare a kind of biphasic ceramic biologic active bone and study its biocompatibility. ［Method］Biphasic ceramic biologic bone(BCBB) was mixed with collage type I, bone morphogenetic protein (BMP) and basic fibroblast growth factor (bFGF) , and then the third generation cultured rabbit bone mesenchymal stem cells (MSCs) were seeded on BCBB/BMP/bFGF in vitro.The tissue engineering bone(BCBB/BMP/bFGF/MSCs) was observed by upside down microscope, scanning electron microscope (SEM) and examined using methylthiazol tetrazolium  (MTT).［Result］Biphasic  ceramic  biologic  active  bone BCBB/BMP/bFGF was successfully prepared by reconstituting collage type I, BMP,bFGF and BCBB together. The rabbit cells grew in and on the BCBB/BMP/bFGF to form an ideal tissue engineering bone, and the cells quantity was the most on the 6th day.［Conclusion］BCBB/BMP/bFGF possesses a good biocompatibility with rabbit bone mesenchymal stem cells.

    Key  words：biphasic  ceramic  biologic  bone(BCBB);  bone morphogenetic protein;  basic fibroblast growth factor;  mesenchymal stem cells;  biocompatibility

    骨组织工程的研究主要集中在支架材料、种子细胞、生长因子、组织器官的构建等方面，而支架材料细胞相容性是材料能否应用于临床的重要因素。骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cells，  MSCs)是目前骨组织工程最有临床应用前景的种子细胞［1］。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastg rowth factor，bFGF)是近来研究得较深入的两种骨生长因子［2］。本研究将兔MSCs分离培养后，与复合有BMP和bFGF的双相陶瓷生物骨(biphasic ceramic biologic bone，BCBB)联合培养，了解双相陶瓷生物活性骨BCBB／BMP／bFGF的细胞相容性，为进一步研究奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  双相陶瓷生物活性骨(BCBB／BMP／bFGF)的制备

    BMP由第四军医大学西京全军骨科研究所提供，已经小鼠肌袋实验证明有骨诱导活性。称取600 mg BMP溶于10 ml浓度为4 mol／L盐酸胍溶液中，置4℃冰箱中保存24 h后，取出后匀浆，然后4℃透析48 h，每24 h更换透析液1次，得到BMP溶液。取碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)每支150万IU／mg，用1 ml蒸馏水溶解后，分装为10份，每份100 μL含bFGFl5万IU。分别各取bFGF溶液96 000 IU(64 000 ng)。取I型胶原溶液20 ml，与上述BMP溶液和bFGF溶液混合，电磁震荡器震荡10 min，将混合液与60块0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的BCBB骨粒及5 mm×5 mm×1 mm薄片20块充分混匀(每块骨粒含BMP10 mg，bFGF 1 600 IU)，负压抽吸、冻干，制得双相陶瓷生物活性骨。环氧乙烷消毒后无菌条件下封装备用，同时留样品送细菌培养，并证实无细菌生长。

    1.2  双相陶瓷生物活性骨的结构观察

    从冻干后的双相陶瓷生物活性骨中取样，做扫描电镜(SEM)观察。

    1.3  MSCs的分离培养

    两周龄日本大耳兔5只，昆明医学院动物中心提供，体重约150～200 g(合格证号：滇实动证第2003064号)。脱颈处死，0.1%的新洁尔灭中浸泡10 min，无菌条件下剥离出双侧股骨、胫骨，PBS冲洗3遍。注射器吸取L-DMEM培养基冲洗股骨、胫骨髓腔，将含有骨髓的冲洗液转入离心管，  800 r／min离心10 min，弃去上清液，加入L-DMEM完全培养基10 ml(青霉素100 U／ml，链霉素100 μg／ml，15%新生牛血清，HEPES 0.0l mol／L)，吹打均匀后加入2个底面积为25 cm2的培养瓶中，置37℃，5%CO2饱和湿度培养。视情况每2～3 d全量换液一次。当原代细胞融合并覆盖瓶底80%以上时，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例传代培养。取第3代细胞与双相陶瓷生物活性骨复合培养。

    1.4  双相陶瓷生物活性骨与MSCs的复合培养

    1.4.1  MSCs在双相陶瓷生物活性骨上增殖的倒置相差显微镜观察及MTT法测定

    分别将5 mm×5 mm×1 mm BCBB材料20块置于5块96孔培养板中预湿，每块板的A1、A2、A3、A4孔各放1块BCBB／BMP／bFGF材料。4 h后将密度为1×106／ml的第3代骨髓间充质干细胞20 μl接种于96孔培养板的预湿材料上，CO2培养箱中培养4 h，再分别加80 μl含15%新生牛血清的L-DMEM培养基继续培养，A9、A10、A11、A12孔单纯加相同培养基作为本底，每1 d换液一次。倒置相差显微镜观察。分别在第1、2、3、6、8 d时取出1块板加MTT10 μl，4 h后加三联液100 μl，12 h后用酶标检测仪在570 nm波长下测定各孔光密度(OD)值。根据细胞在材料上的增殖曲线确定最佳移植时机。

    1.4.2  双相陶瓷生物活性骨与MSCs联合培养的SEM观察

    将5 mm×5 mm×5 mm的双相陶瓷生物活性骨10块预湿后按1×106／ml浓度接种细胞，置培养皿中培养，第3、6 d分别取出材料各5块，用2.5%戊二醛固定15 min，干燥后于扫描电子显微镜观察细胞在材料上黏附、增殖情况。

    2  结果

    2.1  双相陶瓷生物活性骨的结构观察

    镜下(SEM×100)可见BCBB孔内充满I型胶原、BMP及bFGF，可见I型胶原和BMP呈云絮状或网纱状，bFGF呈层片状(图1)。

    2.2  MSCs体外培养的倒置相差显微镜观察

    原代培养24 h时部分细胞开始贴壁伸展变形，刚贴壁的细胞单个排列，呈圆形或多角形，胞体透亮折光性强。48～72 h后呈纺锤形或梭形，每个细胞形成一个集落，增殖迅速，集落之间相互靠近。5 d后见贴壁生长的细胞数量明显增多，细胞形态出现较大变化，可见成纤维样细胞散布于培养瓶底，并有集落形成，细胞围绕中心呈漩涡状排列，随之集落逐渐增多、增大，并融合为单层。8 d时细胞基本长满瓶底，呈长梭形，有的细胞呈交叉重叠生长。原代细胞培养8～12 d后传代，传代细胞贴壁较快，刚传代时呈圆形，可见大量细胞悬浮，核透亮，2 h后少量细胞开始贴壁，细胞形态由圆形向梭形转化，之后可见细胞贴壁散在分布，贴壁细胞呈单层生长，伸展为梭形。第3代细胞形态为成纤维细胞样，细胞形态趋于一致，核分裂相多见，第5 d基本长满瓶底(图2)，取此代细胞与材料复合。

    2.3  双相陶瓷生物活性骨与MSCs联合培养的倒置相差显微镜观察

    由于材料透光性差，倒置显微镜无法直接观察细胞在BCBB表面生长情况，可观察到贴附在BCBB孔隙边缘的MSCs，并见细胞贴附于培养板底生长。培养3 d的载体上可见有少量细胞生长，形态不规则；培养6 d的载体上细胞明显增多，有的细胞突起与其他胞体相连。

    2.4  双相陶瓷生物活性骨与MSCs联合培养的SEM观察

    在培养3 d的载体上可见有少量细胞生长，形态不规则，培养6 d的载体上细胞明显增多(图3)，可见少数细胞变圆，为处于分裂期细胞，多数细胞呈长梭形，随材料表面特征成一定方向排列。细胞表面有多个细长突起，细胞突起交互连接呈网状，有的与其他胞体相连。

    2.5  双相陶瓷生物活性骨与MSCs联合培养的MTT法测定

    第1，2，3，6，8 d时取出一块板加MTT进行OD值测定，细胞在材料上增殖的OD值如表所示(表1)，用联合培养组OD值减去本底的OD值，根据所得结果制出增殖曲线。MSCs的生长曲线呈S形，传代接种后第1～3 d细胞增殖缓慢为潜伏适应期，此期主要为MSCs的贴壁生长阶段。从第4 d开始细胞增殖加速，细胞曲线显示此阶段细胞数目呈指数级递增，此期为MSCs的对数生长期。第6 d达到顶点后，细胞不再增殖，生长活动停滞，  MSCs生长进入一个平台期。之后，细胞数量轻度下降。第6 d时，MSCs载体联合培养细胞增殖达稳定期，此时为移植的最佳时机(图4)。表1  细胞在材料上增殖的OD值

    3  讨论

    评价材料生物相容性的方法主要有两种：一种是体内直接植入法，即将材料植入体内，不同时间段取出作大体和组织学检查；另一种是体外复合细胞培养法，即将材料与细胞进行体外培养，检测细胞的增殖与功能情况。体外复合细胞培养法是近年来采用的主要方法。它对材料毒性敏感性高、重复性好，简便、易行、快速、易于控制实验条件［3］。该实验用BCBB为支架，用免疫原性低、生物相容性好、支持成骨细胞黏附分化的I型胶原修饰BCBB表面［4］，并复合以促进成骨细胞、成软骨细胞分化增殖的BMP和bFGF［2］，制成双相陶瓷生物活性骨。扫描电镜观察到I型胶原、BMP、bFGF有效地复合到了双相陶瓷生物骨(BCBB)上，制得双相陶瓷生物活性骨，将其与MSCs复合培养。  图1镜下可见BCBB孔内充满I型胶原、BMP及bFGF(SEM×l00)

    图4BMSCs与双相陶瓷生物活性骨联合培养的细胞增殖曲线    MSCs体外长期培养往往存在细胞老化及生物学功能退变等问题［5］。在该实验中，MSCs经3次传代体外培养不断纯化后获得的MSCs其纯度较高、增殖生长能力强。因此作者选择取第3代细胞与双相陶瓷生物活性骨复合培养。

    MSCs的数量及密度直接影响其增生和分化。目前国内外报道MSCs在支架材料上的移植浓度多为5×105～7.5×106个／ml［5］，本研究将浓度为1×106／ml的MSCs种植于双相陶瓷生物活性骨上，在体外进行三维立体培养，用二甲基四氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)测定细胞与材料联合培养时增殖达稳定状态的时间，通过测定OD值间接反映细胞生长及增殖活性［6］。根据增殖曲线变化确定第6 d时细胞在材料表面形成致密细胞层，可见细胞突起交错，细胞在材料表面生长状态良好，细胞增殖达稳定状态。表明该双相陶瓷生物活性骨具有良好的细胞黏附性和细胞相容性。

    总之，MSCs能在双相陶瓷生物活性骨(BCBB／BMP／bFGF)表面黏附生长、增殖，双相陶瓷生物活性骨具有较好的细胞相容性。第6 d时，MSCs与双相陶瓷生物活性骨联合培养细胞增殖达稳定期，构建了理想的组织工程骨，表明MSCs与双相陶瓷生物活性骨联合培养构建组织工程骨是可行的。但是本实验尚属初步观察，还需要体内成骨定量、成血管和骨修复等进一步研究。

【文献】
  ［1］ Xie C, Keynolds D, Awad H, et al. Structural bone allograft combined with genetically engineered mesenchymal stem cells as a novel platform for bone tissue engineering［J］. Tissue Eng，2007,13:435-445.

［2］ Divya P, Sreerekha PR, Krishnan LK, et al. Growth factors upregulate deposition and remodeling of ECM by endothelial cells cultured for tissue-engineering applications［J］. Biomol Eng，2007,24:593-602.

［3］ Wang H, Li Y, Zuo Y, et al. Biocompatibility and osteogenesis of biomimetic nano-hydroxyapatite/polyamide composite scaffolds for bone tissue engineering［J］. Biomaterials，2007, 28:3338-3348.

［4］ Catherine D, Andres J, et al. Alpha-2beta-1 integrin-specific collagen-mimetic surfaces supporting osteoblastic differentiation［J］. J Biomed Mater Res, 2004, 69: 591-600.

［5］ Siddappa R, Femandes H, Liu J, et al. The response of human mesenchymal stem cells to osteogenic signals and its impact on bone tissue engineering［J］. Curr Stem Cell Res Ther，2007:209-220.

［6］ Jiao S. Diferetal cytotoxic sensitivity among MTT, NR and Alpase activity assays in human pulp cells exposed to dental resin monomers［J］.Chinese Journal of Biomedical Enginerring, 1998,7:37-46.