DCC基因与结直肠癌的研究进展
【关键词】 DCC基因 结直肠癌 研究进展
结直肠癌是常见的人类消化道恶性肿瘤，在西方发达国家及我国部分地区，其发病率居恶性肿瘤第二位。它的发生、是一个涉及多基因、多步骤、多阶段参与的复杂过程，包括癌基因的激活，抑癌基因的缺失或失活，错配修复基因的突变及危险修饰基因改变等。其中抑癌基因的异常在结直肠癌的发生、发展过程中起重要作用，其失活或缺失导致该基因的功能缺失，从而导致细胞去调节性生长和转移潜能[1,2]。结直肠癌缺失基因(deleted in colorectal carcinoma，DCC)是一个重要的抑癌基因 ，与结直肠癌的发生、发展、转移、预后关系密切，由Fearon等[1]于1990年确定并命名，本文就其研究进展综述如下。
1 DCC基因
1.1 DCC基因及蛋白结构 Vogelstein等[2]发现结直肠癌染色体缺失最常发生在17p和18q,发生率通常在70℅以上，其中17p等位基因缺失丢掉了p53基因，由此推测18q缺失可能也丢掉了一种抑癌基因。这个关键的区域可能存在于18q21.3和端粒之间。1990年Fearon等[1]用探针p15～65作southern杂交将其准确定位于18q21.3，在这个部位进行cDNA克隆并筛选，对所筛选克隆进行序列分析，发现所有克隆均包含一转录体的重叠部分，该转录体内有单一开放阅读框架，于是把编码这一转录体的基因称作DCC基因。DCC基因定位于人染色体18q21.3，全长300～400kb，至少含有28个外显子,cDNA长约4341bp。Cho等[3]从基因库里分离出含所有已知编码序列的噬菌体，克隆其完整全长1.4Mb,确定了第 29号外显子的存在，并确定了每个内外显子的边界序列。DCC基因的表达蛋白是Ⅰ型跨膜糖蛋白，由1447个氨基酸组成，相对分子质量为190KD。该蛋白主要包括3个功能区，即胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区是结合其配体Netrin?1的区域，由4个免疫球蛋白结构域IG(Immunoglobulin)和6个Ⅲ型纤维连接蛋白结构域FN3(Fibronectin TypeⅢ)组成，簇集的免疫球蛋白和纤维连接蛋白样功能区为神经细胞黏附分子(N?CAM)等免疫球蛋白超家族的特点，已知N?CAM及其它细胞表面糖蛋白相似的机制，参与细胞之间，细胞与基质之间的相互作用，使细胞维持正常的分化和生长。跨膜区富含疏水性氨基酸[1,4]。胞内区是信号传导区，包括Caspases切割位点，而Caspases是细胞凋亡通路的主要蛋白酶。作为依赖性受体，缺乏配体Netrin?1时，DCC诱导细胞凋亡，在Netrin?1存在时，DCC与其结合则对细胞凋亡起抑制作用。
1.2 DCC基因诱导凋亡的机制 Tanaka等[5]向DCC缺失的直肠癌细胞中导入含有正常DCC基因的18号染色体，发现细胞恢复了DCC的表达能力后，能有效抑制肿瘤细胞的生长速度、集落形成及裸鼠体内的致瘤能力。Narayanan等[6]用转化可能性很低的 Rat?1纤维母细胞 ，建立了能稳定表达的地塞米松可诱导的 DCC反义 RNA的细胞株，这种细胞生长率增加，并且使裸鼠具有了致瘤性。目前关于DCC的确切机制尚不清楚，但研究发现DCC发挥肿瘤抑制作用可能与其能够诱导细胞发生凋亡有关。Mehlen等[7]人发现缺乏配体Netrin?1时，DCC诱导细胞凋亡，反之与Netrin?1结合时则抑制凋亡。因此，DCC具有"依赖性受体"的功能DCC的ADD(Addiction Dependence Domain)位于Caspase切割位点的上游，通过被Caspase切割后释放羧基末端引起结构变化而暴露。最近有学者[8]认为DCC诱导凋亡可能与死亡受体通路或线粒体通路不同。在缺乏Netrin?1时， DCC?Caspase活化复合体即凋亡体(apoptosome)的形成，它包括了APPL(也称为DIP13a)。在此过程中不需要线粒体释放细胞色素C、也不需要与凋亡蛋白酶激活因子APAF1(apoptotic protease activating factor 1)相作用，APPL能直接结合DCC，在介导 DCC诱导凋亡方面起正性作用。这表明DCC拥有一个新的凋亡通路。另外，Kim等[9]发现netrin?l能够通过泛素一蛋白酶体途径降解细胞表面的DCC，从而调节DCC蛋白的表达。
2 DCC基因失活的机制及检测的方式
2.1 失活的机制 抑癌基因失活的方式有：等位基因缺失、点突变、染色体重组、抑癌基因产物与病毒或细胞的失活蛋白结合等[10]。而DCC基因的改变方式主要有：等位基因杂合性缺失、5'?端纯合性缺失、外显子的点突变以及DCC基因过甲基化等[11] 。等位基因杂合性缺失可能是DCC基因失活最普遍的机制。多数研究表明， DCC等位基因的杂合性缺失(Loss Of Heterozygosity ，LOH)发生率一般在66%～75%之间。如Fearon等[12]在41例结直肠癌中检测到29例(71%)DCC 基因等位缺失近年来位于DCC基因3号外显子的201密码子点突变较为受到关注，突变形式为CGA(精氨酸)??CCA(甘氨酸)。RIEKO MINAMI等[13]分析了191结直肠癌患者的肿瘤组织(36例为扁平型，81例为息肉型，74例为进展期)及30例正常对照组织，201密码子的突变率扁平型为62%，息肉型55%，进展期为58%，而正常对照组的仅为17%。这项研究提示201密码子的突变不仅与结直肠癌的早期发生有关，还可作为筛选结直肠癌高危组的生物学标记。马利民等[14]采用等位基因特异性 PCR,AS?PCR结合SalI酶切方法检测35例结直肠癌组织及配对的癌旁黏膜DCC基因201密码子突变情况，发现DCC基因201密码子纯台突变率结直肠癌(40%)，显著高于癌旁黏膜 (2.8%)，且与肿瘤侵袭深度、Dukes分期相关。至少有l7例(49%)结直肠癌与相应癌旁黏膜相比增获一个密码子突变。提示201密码子突变与结直肠癌侵袭、 转移能力加强密切相关。这对于 DCC基因失活与结直肠癌发生的关系很有意义。
2.2 DCC基因变异的检测方式 目前用来检测 DCC变异的方法主要有:(1)通过PCR扩增?聚丙烯酰胺凝胶电泳分离或者通过荧光PCR自动生成以检测肿瘤组织的微卫星不稳定性;(2)应用PCR?SSCP、DHPLC和DNA测序等方法检测DCC基因突变;(3)应用甲基化特异性PCR检测DCC基因的甲基化状态。这些方法各有其优缺点，微卫星不稳定性可以间接反映DCC基因是否失活，较为简单，可靠，但该方法没有真实地反映出微卫星位点在全部DNA序列上的变异。SSCP或DHPLC可以检测DCC基因突变的情况，但是每次反应只能检出检测基因的个别外显子，而且不能确定变异位置和变异类型，检测DCC基因甲基化状态可以反映DCC甲基化情况，对于肿瘤非遗传机制的研究可以提供一个依据，但甲基化状态的研究放映的只是DCC基因发生改变的可能的一小部分机制而已。因此，在对DCC基因进行研究时，我们有必要对以上技术进行筛选，根据目的要求选择合适的方法。
3 DCC基因与结直肠癌
3.1 DCC基因失活与结直肠癌的发生、发展 大多数研究表明DCC基因的失活与结直肠癌的发生、发展成正相关。Mazelin L等[15]用小鼠(APC)/DCC基因敲除模型显示小鼠DCC基因的缺失。DCC基因具有促细胞凋亡作用，这与半胱氨酸蛋白的裂解作用有关，半胱氨酸蛋白暴露于DCC受体的抗凋亡区域，可被netrin?1抑制。在小鼠模型上过度表达的netrin?1和APC基因的缺失抑制了促细胞凋亡作用，并可能跟促进肿瘤生长有关。Vogelstein等[1]报道,在结直肠黏膜上皮由正常上皮转化为增生上皮和腺瘤,并演进到癌变的过程中,有47%的进展期腺瘤(腺体或细胞呈中、重度不典型增生)和73%的结直肠癌细胞中可检出染色体18q有DCC等位基因的杂合性缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH),但在早中期腺瘤(<110 cm) 很少见。而在90%的有18qLOH的病人中,缺失区包含了DCC基因位点[5,16]。Goi等[17]用Westernbloting法检测结肠癌及腺瘤中的DCC蛋白表达情况,则发现癌组织中DCC蛋白明显减少或缺失,在腺瘤组织中DCC蛋白有明显表达,与正常组织几乎相同,提示DCC基因缺失或失活是结肠腺瘤向癌转变的一个促发因素。而另外一些专家认为DCC基因的缺失与否与结直肠癌没有直接关系。如Keino?Masu K等[18]研究表明DCC基因编码的蛋白是netrin?1介导作用的受体复合物的组成部分，netrin?1参与了轴突导向。对人类结直肠癌的研究表明只有7%的结直肠癌有netrin?1的过度表达，这可能提示18q上基因缺失DCC受体复合物的缺失或突变对人类结直肠癌细胞的筛选并没有特别的优势。
3.2 DCC基因失活与结直肠癌的转移和预后 大部分学者认为DCC基因的失活促进了结直肠癌的转移，包括淋巴结转移，肝肺转移等，从而使其预后更差。Jen等[19]发现没有DCC基因缺失的二期直肠癌患者的生存率和三期患者相同，而DCC基因缺失者则与一期患者相同 ， 均提示DCC基因和肿瘤转移潜能有关。 Kato等[20]通过对30例结直肠癌无肝转移，24例结直肠癌有肝转移及9例术后肝转移进行研究，发现发生肝转移病例与未发生肝转移病例DCC基因缺失率分别为95%∶40%，因此认为DCC基因的缺失可能与结直肠癌的肝转移有关。MARTIN[21]研究发现，DCC蛋白可以作为肿瘤转移或局部浸润性生长的抑制因子，与导致肿瘤细胞相互作用及黏附功能减弱有关，DCC蛋白功能的丢失与肿瘤的转移和不良预后有密切关系。国内学者吴文溪等[22]采用免疫组化法检测40例正常结直肠黏膜，66例结直肠癌及相应癌旁组织DCC蛋白的表达情况，结果显示结直肠癌DCC蛋白阳性表达率为39.4%。不仅明显低于癌旁组织(97.0%)和正常对照组(100%)，而且与结直肠癌淋巴结转移及肠壁浸润深度呈负相关。Shibata等[23]对132例石蜡油包埋的完整切除的DukesB 和DukesC期结直肠癌标本用免疫Zetter组化的方法来检测DCC基因的表达并长期随访，发现DCC基因表达正常的DukesB期患者5年生存率是94.3%，同期DCC基因表达缺失的患者5年生存率是61.6% ，DukesC期的分别是59.3%和 33.2%.由此说明了DCC基因是DukesB 和DukesC期结直肠癌强有力的预后指标，但是这项研究采用Western blotting法检测结直肠癌中DCC蛋白的表达情况时，发现DCC蛋白的表达与否和肝转移没有相关性。而Gotley DC等[24]通过比较结直肠的正常黏膜，腺瘤组织，癌组织及肝转移组织的DCC蛋白表达，认为DCC基因与大肠癌的进展及肝转移并无直接关系。在研究DCC基因表达与患者预后的关系中， Saito M等[25]比较DCC基因表达正常组和DCC基因缺失组的5年生存率分别为91.0%和58.8%，两者之间有显著差异，提示 DCC基因可能可以作为预后的一个生物学标记。
4 问题与展望
DCC基因是目前发现的最长的人肿瘤抑制基因，尤其在结直肠肿瘤的发生中具有重要意义，其失活和表达异常与结直肠癌的诊断、、转移及预后关系密切。尽管目前对DCC基因的研究有了很大的进步，但是关于DCC基因的失活机制、DCC蛋白的功能、DCC基因与其它基因是如何协同作用与结直肠癌的发生、发展过程中DCC基因诱导细胞分化的机制尚未完全清楚。 DCC基因失活及DCC蛋白表达缺失是否可以作为一个独立的预后因素用于指导临床治疗工作等仍然有许多问题有待于进一步解决。
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