骨髓间充质干细胞修复关节软骨缺损研究进展
【关键词】 骨髓
关节软骨缺损很常见,30岁以上的美国人罹患有症状的髋或膝关节炎的发病率为9%,每年造成直接成本为286亿美元。由于不断攀升的发病率和不令人满意的远期临床疗效,使得关节软骨修复在21世纪仍然是临床的巨大挑战。软骨组织工程的出现为解决这个问题提供了新思路,使软骨组织缺损的完全再生成为可能。
1 关节软骨的结构及损伤特点
关节软骨属于透明软骨,覆盖于长骨末端,主要作用是减少关节表面的摩擦。组织学上胶原成份主要由Ⅱ型胶原构成,光镜下基质略呈均质性。关节软骨具有层次特点,从表面到深部依次是:表面切线区、移行区、辐射区和矿化区。各区域在细胞形态和密度、胶原原纤维含量和排列方向上具有一定的差异,整个关节软骨基质内的胶原原纤维呈拱形排列,有加固软骨组织的作用。关节软骨中,软骨细胞仅占软骨体积的5%~10%。基质的主要成分是:水(占66%~78%)、胶原(占13%~18%)和蛋白多糖(占7%~10%),这些基质成分共同维持软骨结构和功能的稳定。
软骨缺损可由创伤、磨损、赘生物、先天性畸形等引起。创伤是导致关节软骨缺损的最常见原因,主要是由于运动或意外事故造成。损伤所产生的剪切力可导致关节软骨压迫性骨折或骨软骨分离。
关节软骨属于透明软骨,受损后被周围组织形成的细胞和基质恢复和替代,但软骨组织的修复能力很差,它的组织学和生物学特性限制了它的修复能力,多不能恢复原有的结构和功能:(1)缺乏血管,使未分化间质细胞无法进入损伤部位进行类似其他组织的愈合过程;(2)软骨组织本身缺乏修复缺损所必需的未分化细胞;(3)软骨细胞包埋于致密的胶原-蛋白多糖基质中,限制了细胞的增殖和迁移能力;(4)成熟的软骨细胞受到损伤时的合成能力虽然增加,但很有限而不能满足修复的需要[1]。
2 应用MSCs修复关节软骨
间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有典型的干细胞特点,终身存在于骨髓和其他组织器官中,负责组织的修复和更新,而且具有多向分化潜能,在不同的诱导条件下可以分化成许多不同的组织[2],如骨组织、软骨组织、脂肪组织、内皮组织、肌肉组织、神经组织、上皮组织等。由于MSCs的自我复制和多向分化的能力,近年来成为组织工程骨构建过程中最常用的种子细胞[3]。骨髓MSCs取材方便、创伤小且易于从骨髓中分离及体外扩增纯化,不像滑膜、脂肪等来源的MSCs原代培养需要酶消化预处理。骨髓MSCs虽仅占有核细胞数的0.001%~0.01%,但始终稳定保持分化成软骨细胞的能力,是终身可用的软骨前体细胞。骨髓MSCs具有CD105(即TGF?β受体),细胞成软骨潜能似与CD105表达有关。与滑膜、脂肪等来源的MSCs相比,骨髓MSCs标志基因在平面培养时差异不明显,而在三维高密度培养时基因差别显著,有且只有骨髓MSCs的软骨分化才能获得明显的改善,所以是用于软骨组织工程学研究较理想的种子细胞[4]。
通过对MSCs细胞的分离和体外培养以及对培养条件的控制,可以促进MSCs细胞分化成软骨细胞。
3 载体选择
应用于关节软骨缺损修复的支架材料有很多,它为组织形成提供空间架构支持,在促进组织形成方面也起着关键的作用。主要有2种,一类是天然材料,另一类是人工材料。
天然材料的支架材料包括藻酸钙、胶原、纤维蛋白、壳聚糖、透明质酸和硫酸软骨素等。天然支架的优势在于来源广泛,价格低廉,具有良好的生物相容性,对机体刺激作用较小,同时具有细胞识别信号(如RGD序列等),利于细胞粘附、增殖和分化,其有机、无机成分比例合适,具有比人工合成材料更好的微结构和功能。天然材料的缺点是机械性能差,还有可能存在免疫原性和不同批次质量差异的问题,因此其应用受到限制。目前在软骨工程领域,应用最多的主要有胶原和纤维蛋白2种材料。
人工材料包括聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇对苯二酸酯—聚丁烯对苯二酸酯(PEGT?PBT)、聚氨酯(polyurethane)、聚乙烯氧化物(polyethylene oxide)等。优势在于可批量生产,重复性好,形态结构可控性强,能规模生产,但生物相容性并非很理想,亲水性差,对细胞吸附不足,降解过程代谢产物产生炎性反应。
为了克服人工合成材料和天然材料各自存在的缺陷,将人工合成材料和天然材料复合制成复合支架,使其兼具二者优点。如三维PLA?藻酸盐混合支架,异丙基丙烯酰胺与水溶性壳聚糖之热敏共聚物复合支架等。目前还有学者利用纳米材料制成仿生支架,使其更利于诱导软骨细胞形成。
4 生长因子选择
正常软骨组织由软骨细胞和细胞外基质组成。各种生长因子,包括TGF、IGF和FGF等,对于软骨细胞的增殖、分化和保持稳定性有重要作用,它们共同维持着软骨组织的结构和功能。软骨组织工程研究采用的生长因子包括BMP、 FGF、TGF?β、IGF和FDGF等,这些生长因子能增强或维持软骨细胞表型的表达,也可激发非软骨细胞表达软骨细胞的表型,在软骨细胞的体外培养研究中均能不同程度地促进软骨的形成。
BMP己生产出了人BMP?1~BMP?7。可以促进祖母细胞聚集及向软骨细胞的分化。
FGF 以bFGF和aFGF两种形式存在。能增加前成骨细胞样细胞的数量,使其骨钙素含量增加,碱性磷酸酶活性下降,促进软骨细胞增殖和分化。
TGF?β对细胞生长和细胞外基质合成具有多功能调节作用。可以促进未分化或分化早期软骨细胞DNA合成、增殖和细胞外基质合成,抑制成熟软骨细胞增殖和分化,抵抗软骨基质分解代谢,是MSCs向软骨细胞分化的关键因素[5]。TGF?β具有双重性作用,有双向调节能力,对成年动物骨髓MSC的作用与剂量有关。
IGF促进多种来源的软骨种子细胞增殖,维持软骨生长和刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原。
PDGF可增加MSC的IGF?1产量,刺激软骨细胞DNA复制和合成Ⅱ型胶原。
5 修复方法
5.1 基于软骨下刺激的关节软骨修复
小至中等大小的关节软骨缺损(1~5 cm2)的病人可以使用骨髓刺激。软骨下骨打孔法,由Pridie于1959年首先提出并应用,即在关节软骨缺损区从表面向软骨下骨板钻孔至出血。微骨折术,在关节镜下切除缺损软骨全层,用锥钻打孔至出血而获得髓腔中的干细胞和营养,以进行修复。不同于钻孔术,它能够产生一个二维的再生空间,且不引起热源性骨坏死。这2种治疗选择的基础是刺激干细胞分化成纤维软骨细胞,形成纤维软骨,修复入关节缺损处[6]。这种修复最终形成的是纤维软骨,它不同于正常透明软骨的机械特性,但是可以覆盖下面的骨质,这样就可以减轻疼痛和肿胀的症状。Gudas等[7]应用微骨折术治疗29例膝关节软骨缺损患者,分别于6、12、24、36个月进行MRI,ICRS评分和修订的HSS评分分析,显示优良率为52%。
5.2 组织工程化软骨修复
应用MSCs的组织工程化软骨主要有种子细胞-支架和种子细胞-支架-细胞因子2种形式。
5.3 种子细胞-支架复合物
种子细胞-支架复合物是利用支架对细胞的良好相容性和支持性,将种子细胞和载体共同培育获得工程化软骨。支架可以维持软骨缺损内的细胞并作为载体诱导透明软骨细胞。Wakitani等[8]报道临床2例骨性关节炎患者进行高位胫骨截骨术同时以自体骨髓MSCs为种子细胞,复合胶原凝胶移植,修复股骨内髁关节软骨缺损。在移植术后6周时可见缺损处形成白色或粉红色的修复组织,部分组织异染阳性。42周后,缺损表面可观测到白色的软骨组织,局部可观测到类似透明软骨的组织,异染均为阳性。Uematsu[9]等报道的MSCs复合三维PLGA支架应用显示:用兔自体骨髓血分离出MSCs种植于三维PLGA 支架,共同体外培养2周后移植修复兔膝关节软骨缺损。术后4周,骨软骨缺损被新形成的光滑白色组织所填充,但是边缘与周围正常软骨组织有颜色不同的界限。组织学观察有培养的细胞和细胞外基质。术后12周,缺损处填充以光滑、白色并有光泽的的组织,类似完整的关节软骨边缘与正常软骨组织模糊。组织学观察有再生的类透明软骨和大量细胞外基质。
5.4 种子细胞-支架-细胞因子复合物
种子细胞-支架-细胞因子复合物是完全工程化的一种组织复合体,旨在体外把种子细胞、细胞支架及促进细胞转化的生长因子重组在一起并植入体内而获得再生的目的组织。修复的基本方法是将体外分离培养的细胞接种到具有一定空间结构和良好的生物相容性的三维支架上,然后将细胞一支架复合物在体外继续培养或植入体内,同时辅以特殊的生长因子。支架材料逐渐降解,为细胞分泌的基质所代替,形成损失组织或器官的结构,并行使功能[10,11]。刘文忠等[12]使用MSCs与纤维蛋白凝胶(FG)及转化生长因子β1(TGF?β1)复合后填充到兔膝关节全厚软骨缺损模型中,术后12周,缺损由类透明软骨或透明软骨修复,II型胶原免疫组化染色阳性,甲苯胺蓝异染性明显,修复面较平整光滑。在关节软骨的修复过程中,生长因子半衰期短,局部使用很快被稀释和代谢,为维持外源性生长因子较高浓度发挥生物学作用。Fan等[13]将携带TGF?β1凝胶微球(MS?TGFβ1)的多孔水凝胶—软骨素—透明质酸支架复合自体MSCs培养后修复兔全层关节软骨缺损,经12、24周观察,试验组与对照组相比,再生软骨细胞在形态学、整合性、与软骨下骨的连续性及再生软骨层的厚度方面均获得了更好的修复。目前基因转染技术成为软骨组织工程的热点。郑东[14]等构建了生长转化因子(TGF?β3)含绿色加强绿色荧光蛋白的真核表达质粒p IRES2?EGFP?TGF?β3,然后用该质粒转染骨髓基质干细胞(marrow stromal cells,MSCs),以促进MSCs向软骨方向分化。实验组在软骨基质胶原II,胶原X,Aggrecan表达量和增加量和蛋白聚糖的表达上都显著高于对照组。
6 展 望
近年来,MSCs及其在软骨组织工程方面迅速,新技术,新理论不断出现。Behrens[15]提出自体基质诱导软骨形成(AMIC)理论方法,使骨髓MSC作为内在软骨修复源成为可能。在德国一个多中心的研究机构研究一种新的技术,可以使MSC在体内增殖和分化并向软骨缺损处聚集[16]。细胞组建中关节软骨生长相关变化的软骨三维成像,体内细胞追踪,微CT扫描重建等技术的应用,为研究软骨组织工程提供了更加有力的方法支持。但是目前仍有许多问题尚待解决。如到目前为止还没有十分完善的分离纯化细胞的方案;移植物在植入体内之前应发育到何种程度为宜,临床上如何更好地促进MSCs与理想材料相容生长并形成软骨?由于对MSCs分化的机制并不明确,这种分化并不稳定,分化率有限,分化后的软骨细胞显示出易退化和衰老的特性。在软骨缺损修复长期观察中发现暂时形成的透明软骨最终会被纤维软骨或纤维组织所替代[17,18]。如何既控制增殖又能在适当的时候调控MSC定向分化成成熟软骨细胞,也是组织工程的一个重要的问题。以干细胞工程为代表的组织工程学是近年来迅猛发展的新领域,干细胞工程作为组织工程的前沿研究,对未来的组织器官修复与替代具有极其重要的作用和深远的影响。尽管还有许多问题需要进一步研究,但MSCs使关节软骨缺损的修复已跨入了临床应用干细胞治疗的时代,有理由相信随着研究的深入和应用的推广,一定会将组织工程化软骨更好的应用于临床。
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[1] Alford JW, Cole BJ. Cartilage restoration, part l: basic science, historical perspective, patient evaluation, and treatment options[J]. Am J Sports Med, 2005, 2: 295-306.
[2] Kassem M, Kristiansen M, Abdallah BM.Mesenchymal stem cells: cell biology and potential use in therapy[J]. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 2004, 5: 209-214.
[3] Tuan RS, Bo land G, Tull R.Adult mesenchymal stem cells and cell?based tissue engineering[J]. Arthritis Res Ther, 2003, 1:32-45.
[4] 胡蕴玉.现代骨科基础与临床[M].北京:人民卫生出版社, 2006,168.
[5] Kim SE, Park JH, Cho YW, et al.Porous chitosan scaffold containing microspheres loaded with transforming growth factor-betal: implications for cartilage tissue engineering[J]. J Control Release, 2003, 1: 365-374.
[6] Steadman JR, Briggs KK, Rodrigo JJ, et al.Outcomes of microfracture for traumatic chondral defects of the knee: average 11?year follow?up[J]. Arthroscopy, 2003,5:477-484.
[7] Gudas R, Stankevicius E, Monastyreckiene E, et al.Osteochondral autologous transplantation versus microfracture for the treatment of articular cartilage defects in the knee joint in athletes[J]. Knee Surg Sports Traumatol Arthrosc, 2006, 9: 834-842.
[8] Wakitani S, Imoto K, Yamanoto T, et al. Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees [J]. Osteoarthritis Cartilage, 2002, 3: 199-206.
[9] Uematsu K, Hattori K, Ishimoto Y, et al. Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a three-dimensional poly?lactic?glycolic acid (PLGA) scaffold [J]. Biomaterials, 2005, 20: 4273-4279.
[10]Arosarena O.Tissue engineering[J]. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg, 2005, 4: 233-241.
[11]Vangsness CT Jr, Kurzweil PR, Lieberman JR.Restoring articular cartilage in the knee[J]. Am J Orthop, 2004, 2:29-34.
[12]刘文忠,汪玉良.骨髓间充质干细胞复合纤维蛋白凝胶修复兔关节软骨缺损[J].临床骨科杂志, 2005,5: 456-459.
[13]Fan H, Hu Y, Qin L, et al. Porous gelatin?chondroitin?hyaluronate tri?copolymer scaffold containing microspheres loaded with TGF?betal induces differentiation of mesenchymal stem cells in vivo for enhancing cartilage repair[J]. J Biomed Mater Res A,2006, 4: 785-794.
[14]郑 东,杨述华,袁晓梅,等.TGF?β3真核表达载体转染骨髓基质干细胞促进其向软骨分化的实验研究[J].矫形外科杂志,2007,6: 455-458.
[15]Behrens P. Matrix?coupled microfracture?a new concept for cartilage defect repair (in German) [J]. Arthroskopie, 2005, 18:193.
[16]Kramer J, Bohrnsen F, Lindner U. In vivo matrix?guided human mesenchymal stem cells[J]. Cell Mol Life Sci, 2006, 5:616-626.
[17]De Bari C, Dell'Accio F, Luyten FP.Failure of in vitro?differentiated mesenchymal stem cells from the synovial membrane to form ectopic stable cartilage in vivo[J]. Arthritis Rheum, 2004, 1: 142-150.