皮质骨I型胶原的提取及胶原-明胶支架材料的制备

【摘要】  探索一种较理想的皮质骨I型胶原的提取方法并制备胶原-明胶支架材料。［方法］以牛皮质骨为原料，经低温液氮粉碎、梯度脱水、脱脂、脱钙处理成为脱钙骨基质粉。通过酶溶解法处理脱钙骨基质粉，经溶解、离心、透析、冻干等步骤获得皮质骨胶原，SDS?PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定其特征；再以胶原、明胶通过冷冻干燥技术制备神经支架材料，扫描电镜观察其内部结构。［结果］所得胶原经SDS?PAGE电泳、氨基酸分析等方法鉴定符合I型胶原特征；制备的支架材料外观呈圆柱状，内部为孔径均匀平行排列的微管结构，具有仿生效果。［结论］皮质骨中能够获得纯度较高的I型胶原，可用于胶原材料的制作。

【关键词】  组织工程 胶原 提取 神经支架

    Abstract：［Objective］To  develop an ideal method for extracting type I collagen from cortical bone and to prepare a collagen?gelatin scaffold.［Method］The cortical bone was disintegrated into bone matrix powder in a high speed mill and was subsequently dehydrated in alcohol,decalcificated in hydrochloric acid and defatted in chloroform:methanol (1:1,v/v).The osscins were extracted using improved pepsin digestion method after the bone matrix powder was dissolved,centrifuged,dialyzed and lyophilized. Type I collagen was then characterized by SDS?PAGE and amino?acid composition analysis. The biomaterial was made of type I collagen  and gelatin using freeze?drying method,and the alignment regularities of microscopic channels and  their course directions were observed under the scanning electronic microscope.The size of the micropores and the factor of porosity were also measured. ［Result］ The collagen extracted was confirmed to be type I collagen by SDS?PAGE and amino?acid composition analysis. All the scaffolds looked like circular cylinder,the microscopic channels were arranged in parallel manners,and the pore sizes of the channels were uniform.［Conclusion］Ossein extracted from cortical bone is a real type I collagen that can be applied in the construction of collagen products.

    Key words：tissue engineering;    collagen;    extraction;    nerve scaffold

     周围神经缺损后的修复再生和功能恢复一直是神经领域的难点和热点。由于周围神经结构和功能上的特殊性，损伤后大多数情况下无法直接对拉吻合，自体神经移植又有诸多限制，因此寻找一种神经替代物来修复缺损是十分必要的。近年来，随着组织工程技术的，用于神经修复研究的材料品种越来越多。目前Ⅰ型胶原蛋白制品为组织工程修复神经研究中应用较多的生物材料之一［1］。Ⅰ型胶原通常来自牛腱、鼠尾或皮肤，由于上述组织中含有大量其它种类的胶原和非胶原成分，提取及纯化工艺复杂。骨中Ⅰ型胶原含量丰富，占骨基质中有机成分的95％以上，本实验将传统的酶提取法加以改进，提取牛皮质骨中I型胶原并制备神经支架材料。

    1   材料与方法

    1.1  骨基质粉的制备

    取新鲜牛长骨，去除软组织、骨膜、骨端松质骨及骨髓，然后将皮质骨劈成骨块，乙醇 (60％、70％、80％、90％)梯度脱水，液氮冷冻后放入高速组织粉碎机中，粉碎为直径0.6～2 mm骨粉，持续搅拌下加入甲醇：氯仿(1∶1，v／v)脱脂48 h，每24 h换脱脂液1次;0.6  mol／L盐酸脱钙84 h，分别于第12、36、60 h换脱钙液，脱钙结束后去离子水洗涤3次备用。

    1.2  胶原的提取

    将50 g牛皮质骨基质粉浸在500 ml 0.05 mol／L冰醋酸和500 mg胃蛋白酶混合溶液中，持续搅拌96 h。待混合物变为无色、透明、粘稠液体后高速低温离心20 min(10 000 r／min)，以去除未溶解杂质。其上清即为液态粗制胶原。在上清中缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20 min(15 000 r／min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol／L冰醋酸溶解，离心20 min(15 000 r／min)，取上清加入5 mol／L NaOH调pH至7.3，缓慢加入NaCl，搅拌过夜，离心20 min(15 000 r/min)，去上清，沉淀物加入0.5 mol／L醋酸中透析溶解，离心10 min(15 000 r/min)，去沉淀，上清装入透析袋中持续透析72 h，每4 h更换透析液1次。最终收获无色透明粘性液体，浓缩冻干。以上液体及操作在4～7℃进行。

    1.3   支架材料的制备

    称取样品150 mg、明胶(Sigma公司)75 mg溶于0.05 mol／L冰醋酸溶液，4℃条件下搅拌90 min(18 000 r／min)，负压抽真空后于4℃冰箱中过夜，充分混合成凝胶状悬浊液后将其注入长10 cm、内径3 mm的硅胶管中，密封两端，顺轴向以自制微型调速仪以2×10-5 m／s的速度浸入冷凝剂中，将悬浊液-硅胶管冷冻物放入预冷的铝盘中，于-40℃、100 mTorr条件中冻干48 h，制得干燥成形的胶原蛋白支架材料［2］。材料用戊二醛交联，60Co消毒密封备用［3］。

    1.4  胶原的鉴定

    1.4.1  取样品2 μg溶于420　μl加样缓冲液(1 mol／L Tris?HCl缓冲液，10％SDS，2％巯基乙醇，50％甘油，微量溴酚蓝)过夜，100℃，5 min，离心10 min(12 000 r/min)，取上清20 μl加样，进行SDS?PAGE垂直平板电泳，浓缩胶5％，分离胶8％，电极缓冲液SDS?Tris?甘氨酸系统，浓缩胶电压40 V，分离胶电压80 V，0.25％考马斯亮蓝R?250染色，以牛腱I型胶原标准品(Sigma公司)作为对照。

    1.4.2  将冻干样品水解后，应用Beckman 121MB 型氨基酸自动分析仪进行氨基酸分析。

    1.4.3  用U?2001紫外可见分光光度计测定胶原最大光吸收波长。

    1.5  支架材料内部扫描电镜观察

    以扫描电镜观察上述制备的胶原蛋白支架材料横截面和纵切面并测量材料内部微孔的直径。   

    2  结  果

    2.1  选择适当时间点换脱钙液，持续脱钙84 h，可将骨粉中的钙离子含量降到较低水平(图1)。

    2.2  胶原样品鉴定结果

    2.2.1  提取的样品冻干后呈蓬松的白色海绵状，具有吸潮性（图2）。

    2.2.2  SDS?PAGE电泳结果显示，提取的胶原样品与Ⅰ型胶原标准品相同（图3）。

    2.2.3  最大光吸收波长检验结果  样品在230 nm波长处显示较强的光吸收，符合胶原特性。

    2.2.4  样品氨基酸分析结果  甘氨酸占氨基酸总量的31.12%，羟脯氨酸占氨基酸总量的9.12%，脯氨酸占氨基酸总量的12.85%，羟脯氨酸与脯氨酸之比约0.71，氨基酸构成比符合Ⅰ型胶原特性（表1）。表1  皮质骨磁针原氨基酸组成

    2.3  扫描电镜观察结果

    支架材料外观为表面封闭的圆柱状结构，电镜下见纵切面为轴向平行排列的微管结构，横切面上微管结构呈内径均一的蜂巢状分布，孔径在20～100 μm，接近于坐骨神经结构（图4、5）。

    3  讨  论

    近年来，应用组织工程技术构建种子细胞和具有良好生物相容性的支架材料复合体——人工神经修复外周神经损伤成为研究的重点。人工神经研究的关键之一在于如何选择合适的支架材料，以便复合种子细胞、神经营养因子从而更好的发挥促神经再生作用。目前，以天然的细胞外基质为原料制备支架材料成了研究的新方向。胶原是细胞外基质的主要成分，广泛分布于骨、肌腱、韧带、皮肤、软骨等结缔组织中，约占动物体内蛋白质总量的1／4～1／3，在细胞的分化、运动化趋向、结缔组织修复等方面发挥重要作用，同时具有生物可降解性、低抗原性、低毒性、能诱导细胞再生及易获得性等诸多优点，可参与组织愈合过程，在软骨细胞再生诱导［4］、角膜移植［5］、人工皮肤制备［6］等方面得到广泛应用，应用在周围神经损伤修复中亦能刺激改善神经的再生［7］。

    图1  钙离子浓度变化  图2  冻干样品  图3  样品电泳图谱  图4  扫描电镜下观察支架材料横切面（×400）  图5  扫描电镜下观察支架材料纵切面（×200）

    以往胶原的提取多集中在相对易于处理的牛腱、猪皮和鼠尾腱。由于胶原是一个大的蛋白家族，从上述组织中提取时分型、纯化难度较大，程序复杂，而且耗时较长，易导致胶原变性。骨胶原的提取纯化报道较少，而骨中有机质90％以上为胶原，主要为I型胶原，有望作为制备I型胶原的重要来源。作者将传统的酶溶解法加以改进应用于骨胶原的提取，在骨粉颗粒直径、脱脂脱钙时间、酶促溶解、抽提次数等方面加以细化，省去分型、纯化等冗长程序，耗时较短，简便。I型胶原的氨基酸组成中，甘氨酸约占氨基酸总量的1／3;含有羟赖氨酸和羟脯氨酸，一般蛋白质中则不存在羟赖氨酸，羟脯氨酸也很少见;羟脯氨酸与脯氨酸之比约为0.7～0.8。本实验样品胶原氨基酸分析符合I型胶原的组成特征，最大光吸收波长在230 nm附近，电泳分析其区带与I型胶原标准品区带相同。结果显示，作者通过实验获得了纯度较高的I型胶原。作者以实验获得的I型胶原和明胶为主要原料，构建了具有微管排列结构的支架材料，其内径在20～100　μm，三维结构上接近于坐骨神经，具有一定的仿生效果。实验表明［8］，将具有促进轴突再生功能的骨髓基质干细胞(BMSCs)种植在支架材料并共培养后，细胞黏附在支架材料内部，生长状况良好，显示支架材料具有良好的生物相容性。综上所述，作者制备的皮质骨胶原，具有较高的纯度，并可用于胶原蛋白材料的制备，具有较好的实用价值。：

【参考文献】
  ［1］ 蒋挺大．胶原与胶原蛋白［M］．北京：化学出版社,2006,242-245．

［2］ Etoh S,Takakuda K,Kawabata K,et al．Evaluation of cross?linking procedures of collagen tubes used in peripheral nerve repair［J］．Biomaterials,2002,23：4475-4481．

［3］ 梁 伟，罗卓荆，王树森，等．修复神经缺损的组织工程支架材料的研制及其生物相容性研究［J］．中华创伤骨科杂志,2004,9：1037-1041．

［4］ Wahl DA,Sachlos E,Liu C,et al．Controlling the processing of collagen?hydroxyapatite scaffolds for bone tissue engineering［J］．J Mater Sci Mater Med,2007，2：201-209．

［5］ Liu Y, Gan L,Carlsson DJ,et al.A simple,cross?linked collagen tissue substitute for corneal implantation［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci,2006,5: 1869-1875.

［6］ Ismarul IN,Ishak Y, Ismail Z,et al. Characterization of collagen/chitosan films for skin regenerating scaffold［J］.Med J Malaysia,2004,59:57-58.

［7］ Stang F, Fansa H,Wolf G, et al. Structural parameters of collagen nerve grafts influence peripheral nerve regeneration［J］.Biomaterials,2005,16:3083-3091.

［8］ 孟 浩，罗卓荆，冯林杰，等.新型神经支架材料的构建及其与骨髓基质干细胞复合的实验研究［J］.2007,12:933-934.