采用直肠部分缩窄法构建出口梗阻性便秘动物模型的研究

【摘要】  目的 采用直肠部分缩窄法构建出口梗阻性便秘动物模型，并研究其生理、病理及组织学特点。方法 通过对大鼠直肠进行不全结扎建立便秘模型，并通过体外拆线解除梗阻。比较建模后大鼠排便状况，及处死动物后直肠内粪便储存状况。观察各组大鼠结肠黏膜病理组织学的改变。采用动态浊度法检测大鼠血浆ET含量，采用放射免疫分析法检测血清TNF?α、血浆MTL以及VIP含量。结果 直肠不全结扎可妨碍大鼠排便，并造成大鼠结肠黏膜的炎症反应。此外，模型组大鼠血浆ET和血清TNF?α含量均较正常组大鼠显著增高（P<0.01），解扎组大鼠血浆ET（P<0.01）和血清TNF?α（P<0.05）含量较模型组显著降低。模型组大鼠血浆MTL水平与正常组、解扎组大鼠无显著性差异，但其血浆VIP含量显著低于正常组（P<0.01），与解扎组无显著性差异。结论 采用直肠不全结扎法构建的出口梗阻性便秘动物模型是一种较合理的动物模型，可用于开展相关的实验研究。

【关键词】  出口梗阻性便秘；动物模型；内毒素；肿瘤坏死因子?α；胃动素；血管活性肠肽

    [Abstract]  Objective  To construct the animal model of outlet obstructive constipation by partly coarctating the rectum of rats, and study the characteristics of physiology, pathology and histology of the animal model. Methods  The model of outlet obstructive constipation was made by partly constricting the rectum of rats, and taking out stitches in vitro to relieve obstruction. The defecation of models, the condition of stool in rectum, and the change of histopathology of mucosa coli were observed. The plasma ET was measured by dynamic nephelometric, and serum TNF?α,plasma MTL and plasma VIP were measured by radio?immunity analyzing. Results  Partly coarctating the rectum could obstruct defecation and result in inflammation of tunica mucosa coli of rats. The levels of plasma ET and serum TNF?αof model group were significantly higher than that of normal group（P<0.01）, and the levels of plasma ET （P<0.01）and serum TNF?α（P<0.01）of relieve obstruction group were significantly lower than that of model group. There was no significant difference in the levels of plasma MTL in all groups, but the levels of plasma VIP of model group were significantly lower than that of normal group（P<0.01）.Conclusion  The model constructed by partly coarctating the rectum of rats is a kind of reasonable animal model. It can be used for empirical study on outlet obstruction constipation.

    [Key words]    Outlet obstructive constipation; Endotoxin; Tumor necrosis factor?α;Motilin; Vasoactive intestinal peptide

    出口梗阻性便秘是以排粪至肛门直肠段而不能顺利排出肛门为主要临床特点的病症，它包括了盆底肌痉挛综合征和盆底松弛综合征，涉及耻骨直肠肌综合征、内括约肌失弛缓综合征、直肠前突、直肠黏膜内脱垂等病症[1]，其发病的病理生理基础尚不十分清楚，临床方法及其疗效都不很明确。本文通过系统动物实验，研究通过直肠不全结扎法建立出口梗阻性便秘的动物模型的可行性，并研究该模型的生理、病理以及组织学特点，希望为今后的相关研究提供合理的动物模型。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物及分组  2月龄SPF级SD大鼠（广州中医药大学实验动物中心提供）60只，体质量（200±20）g，雌雄各半。将动物随机分为3组，即正常组、模型组、解扎组，每组雌雄各10只。

    1.2  动物模型的制备  采用直肠部分缩窄法造模。常规饲养2 d，术前不禁食水，将模型组和解扎组大鼠以35 mg/kg戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，开腹暴露直肠，10号丝线经腹壁从距肛门1～1.5 cm处“8”字形从直肠下绕过再经腹壁引出，丝线引入点和引出点在腹壁相距约0.5 cm。在引出的丝线内套入直径为0.5 cm的铁丝打结，退出铁丝后，直肠被部分缩窄并悬吊于腹壁，但肠壁血运正常。关闭腹腔，大鼠苏醒后予正常饮食。正常组不予处理。

    1.3  标本收集  3组动物分别各自取半数用于ET、TNF?α的检测，另一半用于MTL、VIP的检测。模型组于术后48 h摘眼球取血，其中一管以肝素抗凝，取血2 mL，1500 rpm离心15 min，分离血浆0.2 mL,4℃冷藏，24 h内用于ET检测。二管用干燥试管取血2 mL，常温下静置4 h后-4℃离心，1500 rpm,15 min,分离血清，-20℃冻存，用于TNF?α检测。三管中预加7.5%的EDTA?NA2抗凝剂60 μL及80 μL抑肽酶，取血4 mL，边取血边充分混匀，静置1 h后，-4℃ 3000 rpm离心15 min，分离血浆，取500 μL置EP管中-20℃以下冻存，用于MTL备检，另取血浆1 mL置试管中，各加入丙酮2 mL，充分振摇混匀后-4℃ 3000 rpm离心15 min，将上清液移入干净试管中，常温下吹干，用于检测VIP。取血后颈椎脱臼处死大鼠，开腹，观察直肠内粪便储存状况，并于结扎点远端取完整肠管0.5 cm，10%福尔马林固定。正常组与模型组同期处理，解扎组于术后48 h从体外解除直肠结扎丝线并继续常规饲养至96 h后，处理同模型组。

    1.4  血浆ET的检测  动态浊度法检测，采用北京金山川有限公司开发的EDS?99细菌内毒素测定系统。将实验所需玻璃器皿在250℃下干烤1 h，取样头等用无热源水反复冲洗，除去可能存在的外源性内毒素。KT?200血液前处理液（北京金山川电子有限公司提供）处理血浆，在低于15℃环境中将0.1 mL血浆加入0.1 mL鲎试剂（广东湛江安度斯生物公司提供）中，并充分混合均匀，将试管插入到反应器的试管孔中，待所有试管的透光度都不再继续下降，反应结束。

    1.5  血清TNF?α的检测  采用放射免疫分析法，试剂盒由北京北方生物技术研究所提供，仪器为SN?695 B型放射免疫计数器。

    1.6  血浆MTL、VIP检测  采用放射免疫分析的方法，试剂由人民解放军总提供。采用SN?682型放射免疫计数器。

    1.7  数据处理  数据采用“均数±标准差”（±s）表示，用机统计软件SPSS10.0进行统计分析，统计方法为方差分析，并进行组间比较。

    2  结  果

    2.1  一般情况  正常组大鼠活泼好动，皮毛有光泽，大便成形，开腹后发现直肠和结肠末段间断存积粪便。模型组造模后无排便，蜷卧、竖毛，肛门部毛发润湿，直肠结扎线以上密集地存积坚硬的粪便，肠管明显扩张充血。解扎组在解除直肠结扎线后有排便，精神状况好转，直肠和结肠末段间断存积粪便大约与正常组相同。

    2.2  病理表现  各组大鼠结肠组织常规包埋切片，HE染色，在光镜下比较。正常组大鼠结肠黏膜完整，肠壁各层组织结构均正常，间质血管无扩张充血，未见炎症细胞聚集；模型组大鼠结肠黏膜层及黏膜下层明显增厚，表明间质显著水肿。固有膜内及黏膜下层有大量中性粒细胞和淋巴细胞聚集，间质血管扩张、充血，伴有灶性出血。解扎组大鼠结肠黏膜层仍水肿，程度较模型组减轻，间质血管轻度扩张充血，未见灶性出血，炎症细胞浸润明显减少，且集中位于固有膜和黏膜下层交界区。

    2.3  各级大鼠血浆ET及血清TNF?α含量  结果表明，模型组大鼠血浆ET水平较正常组大鼠显著增高（P<0.01），解扎组大鼠血浆ET水平较模型组显著降低（P<0.01）。同时，模型组大鼠清血TNF?α含量较正常组显著升高（P<0.01），解扎组大鼠血清TNF?α含量较模型组显著降低（P<0.05）。见表1。表1  各组大鼠血浆ET及血清TNF?α含量比注：**VS正常组P<0.01；△VS模型组P<0.05；

    △△VS模型组P<0.01

    2.4  各组大鼠血浆MTL和VIP含量  模型组大鼠血浆MTL水平与正常组、解扎组大鼠无显著差异，但其血浆VIP含量显著低于正常组（P<0.01），与解扎组无显著性差异。见表2。 表2  各组大鼠血浆MTL及VIP含量比较 注：**VS正常组P<0.01

    3  讨  论

    出口梗阻性便秘临床多见，但相关基础研究很少，主要是因为缺少合理的动物模型。本文采用直肠不全结扎的方法构建的动物模型，使大鼠直肠部分缩窄并能维持良好的血运，可阻碍大鼠排出成形的粪便，则大鼠将不断尝试类似于人类出口梗阻性便秘的无效力排动作，对机全生理、病理所造成的影响与人类有极大相似性。此外，本模型可直接从体外拆线解除模型大鼠的直肠梗阻，无需再次麻醉开腹即可进行下一步实验。实验结果表明，模型组大鼠结肠末端储积大量坚硬粪便，肠管扩张，肠壁水肿、充血。病理组织学结果表明，模型组大鼠结肠黏膜曾和黏膜下层明显水肿充血，血管扩张，伴灶性出血，大量炎症细胞浸润。而解除结肠梗阻后，黏膜水肿及炎症细胞浸润等均有显著改善。

    实验结果还表明，出口梗阻性便秘可导致大鼠血浆ET和血清TNF?α升高，解除梗阻后均随之显著下降。ET由细菌胞壁崩解而产生，可引起细胞膜功能的障碍，破坏溶酶体和线粒体。正常情况下，肠道黏膜对ET有强大的屏障作用，但发生便秘时肠内细菌大量繁殖，内毒素释放并破坏坏肠黏膜的屏障作用。ET还可激活多种细胞因子和炎性介质引起全身炎症反应综合征[2，3]，进而对多种脏器造成直接或间接的损害。TNF?α是参与机体免疫反应和炎症反应的重要调节因子，但若产生过多或与其他细胞因子关系失调，又会引起一系列炎性损害，可引起发热、组织损伤、致死性休克。资料表明，静脉注射内毒素后最先出现的细胞因子是TNF[4]，一旦TNF?α分泌出来，炎症反应便会立刻启动，促进其他细胞因子的继发性释放，形成瀑布样连锁放大反应，不通过打破血管内皮细胞的促凝血与抗凝血作用之间的平衡而激活凝血系统，引起严重的组织损伤[5，6]。

    出口梗阻性使得还可导致大鼠血浆VIP水平显著降低，但对大鼠血浆MTL水平影响不大。MTL能促进胃肠道的机械运动，是近年来在实验中常用于判断胃肠道动力的重要指标，多数数学者认为MTL能促进胃肠道各部分的运动，MTL释放减少则胃肠蠕动减弱。新近的研究[7]表明电针刺激大鼠天枢、四白、足三里等足阳明经穴位能促进大鼠肠蠕动，并显著升高大鼠胃窦部和延髓MLT含量。口服有活性的MTL受体激动剂（GM?611）可促进狗的肠蠕动[8]，可使家兔和狗排便更容易而并不导致稀便[9]。VIP是一种具有多效应的生理调节因子，如对胃肠平滑肌活动的调节、对胆囊的影响、对胃肠黏膜黏液屏障的影响、对免疫功能的影响的等。VIP还从多种途径参与影响炎症反应，如Jonsson等[10通过对溃疡性结肠炎患者结肠标本的研究发现，结肠黏膜炎症反应越重其肠黏膜的VIP及其受体表达水平也越低。Gonzalez?Rey报道[11VIP能显著改善实验性结肠炎大鼠的症状，显著减轻结肠黏膜炎症反应的作用有组织病的证据支持。此外，Ivanovska等[12发现外源性VIP能明显减轻酵母多糖诱导的小鼠全身性炎症反应，并同时减少TNF?α产生。从胃肠激素的结果看，在结肠梗阻的早期可能导致大鼠结肠蠕动反应性增高，而随着慢性梗阻进程的延续，对结肠蠕动有何影响尚需进一步研究。

【】
  [1]杨新庆,田波.全国便秘诊治新进展学术研讨会(99’潍坊)会议纪要[J].大肠肛门病外科杂志,1999,5(4):1?3.

[2]Thijis LG,Hack CE.Role of the complement casdade in severe sepsis[J].Clin Int Care,1995,6:581.

[3]Supinski G,Nethey D,Dimareo A.Effect of free radical scavengers on endotoxin?induced respiratory muscle dysfunction[J].Am Rev Respir Dis,1993,148:1318.

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[5]Galley HF,Webster NR,Roy CS,The immunoinflamatory cascade[J].Br J Anaesth,1996,77:11?16.

[6]Ramadori G,Van Damme J,Riedr H,et al.Interleukin?6,third mediator of acute?phase reaction,modulates hepatic protein synthesis in human and mouse[J].Eur J Immunl,1988,18:1259?1264.

[7]Lin YP,Yi SX,Yan J,et al.Effect of acupuncture at Foot?Yangming Meridian on gastric mucosal blood folw,gastric motility and brain?gut peptide[J].World J Gastroenterol,2007,13(15):2229?2233.

[8]Ozaki K,Sudo H,Muramatsu H,et al.Mitemcinal (GM?611),an orally active motilin receptor agonist,accelerates colonic motility and bowel movement in conscious dogs[J].Inflammopharmacology,2007,15(1):36?42.

[9]Sudo H,Ozaki K,Muramatsu H,et al.Mitemcinal(GM?611),an orally active motilin agonits,facilitates defecation in rabbits and dogs without causing loose stools[J].Neurogastroenterol Motil,2007,19(4):318?326.

[10]Jonsson M,Norrgard O,Hansson M,et al.Decrease in binding for the neuropeptied VIP in response to marked inflammation of the mucosa in ulcerative colitis[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1107:280?289.

[11]Gonzalez?Rey E,Delgado M.Therapeutic treatment of experimental colitis with regulatory dendritic cells generated with vasoactive intestinal peptide[J].Gastroenterology,2006,131(6):1799?1811.

[12]Ivanovska N,Kalfin R,Lazarova M,Exogenous VIP limits zymosan?induced generalized inflammation (ZIGI) in mice[J].Immunol Lett,2007,110(2):126?132.