体重监测下硫代乙酰胺诱导豚鼠肝纤维化模型
作者：王小平，赖远辉，许峰峰，甄宇洋
【摘要】 目的 根据体重变化监测硫代乙酰胺(TAA)诱导豚鼠肝纤维化过程中个体反应差异,探索硫代乙酰胺诱导豚鼠肝纤维化模型的可行性。方法 健康雄性豚鼠50只，随机分成三组：对照组10只;实验组40只(TAA六周组20只，TAA九周组20只)。实验组予浓度为0.03%TAA+750 mg/L Vit C饮用水诱导并不限量供应。肝组织用HE染色，Masson三色染色、Gomori银染色法。据肝组织内纤维组织增生状况分为5级：(S0，S1，S2，S3，S4);统计各个体肝纤维化程度。结果 体重比较使用TAA第七周：TAA六周组vs. TAA九周组，P>0.05，实验组间差异无统计学意义。各实验组内个体体重变化存在差异。纤维化形成统计：S0：(对照组10例)，S1：TAA六周组4例，S2:TAA六周组14例，TAA九周组5例，S3:TAA六周组1例，TAA九周组9例，S4:TAA九周组2例。结论 本实验表明硫代乙酰胺可以诱导豚鼠肝纤维化模型。体重监测是一种无创、简便、安全、有效的监测手段。
【关键词】 肝纤维化;硫代乙酰胺;豚鼠
[Abstract] Objective To observe guinea pig’s hepatic and systemic responses to thioacetamide (TAA) during induction of hepatic fibrosis were monitored by weekly-weight changes,to explore the feasibility of inducing hepatic fibrosis model in guinea pigs.Methods Fifty healthy male guinea pigs were divided randomly into three groups:control group(n=10); experimental group(n=40):the six-weeks group(n=20) and the nine-weeks group(n=20) received continuous administration of 0.03% (w/v) TAA+ 0.75% Vit-C in the drinking water.Control group (n=10) received the same concentration of 0.75% Vit-C in the drinking water.The body weights were measured weekly once at same time.Sections of liver about 5 μm thickness were stained with HE and Masson trichrome and Gomori staining method.Fibrosis was classified as:S0，S1，S2，S3，S4.Statistics of all individuals in each group in the degree of hepatic fibrosis were done.Results After in-taking TAA,there was non-significant difference between experimental groups weekly,P>0.05.Each individual’s body-weight has significant difference in experimental groups.S0:control group were 10 cases;S1:TAA six-weeks group 4 cases;S2:TAA six-weeks group 14 cases,TAA nine-weeks group 5 cases;S3:TAA six-weeks group 1 cases,TAA nine-weeks group 9 cases;S4:TAA nine-weeks group 2 cases.Conclusion This experiment showed that thioacetamide can induce hepatic fibrosis model in guinea pigs; Weight monitoring is a non-invasive,simple,safe and effective means of monitoring.
[Key words] hepatic fibrosis;thioacetamide;guinea pigs
本实验拟以硫代乙酰胺(TAA)诱导豚鼠肝纤维化，通过体重变化监测结合肝脏病理的改变观察此模型的动态变化，初步分析豚鼠肝纤维化诱导过程中体重变化监测的作用，初步探索建立豚鼠肝纤维化模型的可行性、稳定性，寻找简便、有效、成模过程干扰少的监测手段。
1 材料与方法
1.1 实验分组与饲养 硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)分析纯(沈阳市试剂五厂，批号595181)。取体重在250～300 g(约3～4周龄)健康雄性豚鼠50只，随机分成两组：对照组10只;实验组40只(其中按TAA持续作用时间分为：TAA六周组20只，TAA九周组20只)。5只/笼，分笼饲养。室温控制在22 ℃左右，12 h明、12 h暗照明。对照组、实验组均予豚鼠基础饲料，不限量供应。对照组不限量供应750 mg/L Vit C[1]饮用水;实验组予含浓度为0.03%TAA+750 mg/L Vit C饮用水诱导并不限量供应，各组饮用水每天配制更换。对照组、实验组均适应性饲养1周。
1.2 肝纤维化模型的制作 1周后实验组始予含浓度为0.03% TAA+750 mg/L Vit C饮用水，不限量供应，配制后饮用水pH值应为6.7～7.2，保证TAA的化学稳定性。
1.3 体重监测 按每周同一天同一时段同一体重计测体重。
1.4 取材方法及处理 饲养第七周末、第十周末用同法处理TAA六周组、TAA九周组与对照组，利用乙醚吸入麻醉后，剖腹后完整取出肝脏及胆囊，放血处死。离体肝组织取自肝右外侧叶1.5 cm×1.5 cm×0.3 cm大小固定在10%甲醛固定液中，用于常规HE染色、Masson三色染色、Gomori银染色法。根据肝组织内纤维组织增生状况分为5级。统计各个体肝纤维化程度。两名病理科专科医师参照2000年西安第十次全国病毒性肝炎及肝病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案中肝组织病理诊断标准[2],根据肝组织内纤维组织增生状况分为5级(S0，S1，S2，S3，S4)。
1.5 统计学处理 所得数据用均数±标准差(x±s)表示。用SPSS 11.0统计软件进行多组资料t检验、Fisher精确检验法，P<0.05即认为差异有显著的统计学意义。
2 结果
2.1 生存情况与体重监测结果
2.1.1 生存情况 饲养第七周末、第十周末用同法处理TAA六周组(19例)、TAA九周组(16例)与对照组(10例)，对照组无死亡;TAA六周组死亡率5%(1/20，1只为急性中毒重症肝炎死亡);TAA九周组死亡率20%(4/20，3只为豚鼠互相撕咬致死;1只为急性中毒重症肝炎死亡)。第七周末各组分为2只/笼。
2.1.2 体重监测结果
2.1.2.1 一般情况 对照组体重按正常变化生理体重逐渐上升，体重增加平稳，豚鼠毛发顺畅光泽好、食欲正常、活动正常。实验组：体重明显下降，幅度最大者超过100 g，豚鼠毛发出现蓬松、食欲不振、活动减少，以上症状尤以体重变化大者为甚。第三、四周后体重缓慢回升，以后呈小幅度升降，个别逐渐上升。豚鼠毛发色泽、食欲、活动逐渐好转。
2.1.2.2 对照组与实验组组间体重均数比较 第一周：TAA六周组(304.25±22.44)g、TAA九周组(303.50±36.60)g vs.对照组(317.50±39.94)g，P>0.05，各组间体重均数比较差异无统计学意义。第七周：TAA六周组(267.63±19.25)g、TAA九周组(276.56±37.36)g vs.对照组(461.00±23.19)g，P<0.05，对照组与实验各组比较差异有显著的统计学意义;TAA六周组vs. TAA九周组，P>0.05，实验组间差异无统计学意义。各实验组内个体体重变化存在差异。见图1。
2.2 肝脏病理改变与纤维化分级
2.2.1 大体观察 对照组肝脏质软、红润，实验组肝脏颜色不同程度变深，浅褐色，质地稍韧。
2.2.2 各组肝纤维化病理分级结果 S0：对照组10例，S1：TAA六周组4例，S2:TAA六周组14例;TAA九周组5例，S3:TAA六周组1例;TAA九周组9例，S4:TAA九周组2例。见表1。体重变化与肝纤维化关系：纤维化程度越高的个体体重变化越大，与病变程度对机体的整体影响是相一致的。见图2。
图1 各组各个体体重变化对比图(对照组1～10;TAA六周组11～30;TAA九周组31～50)表1 各组肝纤维化病理分级结果注：*Fisher精确检验值=51.94,P<0.01，各组间差异有统计学意义
3 讨论
豚鼠属于哺乳纲，肝脏、胆囊适合肝胆系疾病的研究，利用豚鼠是制作胆囊炎、胆囊结石的动物模型已非常成熟。但肝硬化合并胆囊疾患模型的建立尚不稳定，因此设计本实验为建立这一理想模型进行了初步探索-豚鼠肝纤维化模型。在豚鼠上诱导肝纤维化、肝硬化模型国内外较少报道，国外有报道采用铜和黄曲霉素B1诱导幼龄豚鼠肝硬化模型研究印度儿童肝硬化[3];Engin等[4]利用豚鼠胆总管结扎法制造模型，研究NO(一氧化氮)和类花生酸类在肝纤维化形成过程中的相互作用;国内有报道采用四氯化碳灌胃的方法建立豚鼠的肝硬化模型，观察豚鼠的胆石形成情况，成模过程中因急性中毒、营养不良致死死亡率高达35%[5]。硫代乙酰胺是肝脏的间接毒性物，Fitzhugh等[6]报道单剂给药可以造成肝小叶中心坏死，长期给药可引起肝硬化和肝癌，经胃管给药或皮下、肌肉、静脉和门静脉给TAA均可引起肝脏区带状坏死，以细胞核改变为主要损伤，提示可能是干扰了细胞核的RNA向胞质转移。由胺氧化酶作用形成的硫代乙酰胺代谢物多于依赖CYP酶系统(细胞色素P450)所产生的代谢产物，主要为硫代乙酰胺-S-氧化物进而转换成毒性代谢产物，后者与组织分子共价结合引起坏死。其物理化学性质稳定。生化表现类似四氯化碳中毒，血清ALT、LDH异柠檬酸脱氢酶在急性损伤时明显升高。增加程度从3～600倍不等，ALP升高不超过正常对照组2倍，在慢性损伤(如肝硬化)时血清酶水平均正常或仅轻度升高;肝脏病理变化与人类很相近。目前TAA诱导肝纤维化、肝硬化的方法有两种，一是4%TAA按0.2 g/(kg·d)的剂量腹腔注射每周2次连续12周[7];二是0.03% TAA浓度饮用水喂食12～14周建立肝硬化模型比较成熟,另加雌激素诱导可提高成模率[8]。经饮用水给予TAA诱导的优点：(1)简便、无创、、适宜大批复制。(2)肝内药物浓度高于外周血中药物浓度，损害相对较轻，优于皮下注射[9]或吸入[10]等给药途径。另外，避免了腹腔干扰，反复腹腔注射可能的污染及TAA对肝脏、胆囊、腹膜的直接刺激及化学性腹膜炎对机体的整体影响、成模过程的干扰。张杰等[11]报道五周后改变TAA浓度为0.05%可以提高大鼠肝硬化成模率。同时豚鼠的生理特点平均饮用水量为65～150 ml/(d·只)，保证了经低浓度(0.03%)TAA饮用水摄入足量的TAA。根据体重变化剂量个体化给药建立大鼠肝硬化门静脉高压模型,具有动物死亡率低、肝硬化成模率高和造模时间短等优点,适用于肝硬化门静脉高压、淤血性脾肿大的实验研究[12]。Li等[9]报道根据体重变化调整饮用水中TAA给药浓度，达到很好的个体化成模效果;其认为在饮用水中加入TAA诱导大鼠肝硬化时每周称测体重一次即足够，因为给予TAA后大鼠体重下降相对缓慢，死亡多发生在给药后3～6周，并提示本法诱导大鼠肝硬化的几个共同点：(1)每周体重变化在20 g以内，总体重增加在60 g以内，通常提示有足够且适度肝脏损害以维持肝硬化进程。(2)前6周应特别注意肝功能衰竭造成大鼠死亡，其后则应防止诱导肝硬化失败。(3)大鼠对TAA的反应不仅有显著的个体差异，同一个体的反应也随时间进展而不同。本实验利用每周监测体重一次观察豚鼠对TAA毒性反应得出类似结论。本实验表明0.03% TAA在实验组豚鼠上的毒性反应组间差异，无统计学意义。个体间存在差异，但整体变化差异不大，说明豚鼠在固定浓度TAA作用下，可能其摄入体内的TAA量随机体出现的毒性反应程度可能不一，从而经过自身调节达到一定的诱导摄入量。实验组诱导出豚鼠与药物作用时间大致相应的肝纤维化模型;结果表明本实验采用TAA诱导豚鼠纤维化过程中豚鼠对TAA的药物毒性反应在体重监测早期表现出个体差异较大，经机体调节适应后体重变化水平趋于平稳，豚鼠对TAA有很好的耐受性，而诱导后肝脏纤维化病理变化提示豚鼠对TAA易感性好，经饮用水摄入TAA简单、经济、干扰小，可以作为大批豚鼠肝纤维化模型诱导方法。体重监测方法简便、可操作性强，对易于惊吓的豚鼠是一种安全、有效的监测手段，免除了注射的强烈刺激及相应机体应激反应，尤其是诱导后期机体已处于病态。体重的变化直接与TAA毒性反应有关，体重监测在诱导期可以作为个体调整摄入TAA浓度的依据，达到个体化高诱导率。
【】
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