睾酮5-α还原酶Ⅱ基因A49T多态性与影响前列腺癌预后关系的研究

                   作者：佟明，黄伟超，王延柱，李自智

【摘要】  目的 探讨睾酮5-α还原酶Ⅱ(SRD5A2)基因A49T(49密码子苏氨酸替代丙氨酸)多态性与影响前列腺癌预后因素的关系。方法 对A49T多态性位点用Mwo-1限制性内切酶进行酶切鉴定，观察112例前列腺癌患者和89例前列腺增生患者的A49T三种不同基因型(AA、AT、TT)多态性分布情况的差异及其多态性与前列腺癌患者年龄、前列腺特异性抗原(PSA)、游离PSA/总PSA值(F/T)、Gleason评分、临床分期的关系。结果 前列腺癌组与前列腺增生组的A49T基因频度风险无显著性差异(P>0.05)。AT+TT基因型患者发病年龄明显低于AA型(P<0.05)。AT+TT基因型患者Gleason评分平均水平明显高于AA型(P<0.05)。AT+TT基因型可能预后较差。用分段评价PSA、Gleason评分、TNM分期、年龄均与两种基因型无相关性，提示基因型与预后无显著性差异。AA、AT+TT基因型与Gleason评分的关系，等级评分(2～10分)与分段评价法(≤6分、>6分)结果不一致。结论 用等级评分与分段评价法结果不一致。等级评分法比分段法或许更能反映Gleason评分与A49T基因型的关系，更适用于估计预后。

【关键词】  睾酮5-α还原酶Ⅱ;前列腺癌;基因;多态性

　　[Abstract] Objective To investigate the association between A49T polymorphism of SRD5A2 gene and prognosis factors of prostate cancer.Methods PCR was used to examine the A49T polymorphisms of SRD5A2 gene in the tissues of prostate cancer resected from 112 patients(CaP group)and the specimens of benign prostate hyperplasia(BPH group) resected from 89 patients.The association of A49T polymorphism with age of onset，FPSA，TPSA，F/T，T stage，and Gleason score were analyzed.Results There was no significant difference in A49T polymorphism between the CaP and BPH groups(P>0.05).The average age of CaP patients was significantly higher than that of the BPH patients(P<0.05).In the CaP patients，the Gleason score was significantly higher,and the age of onset was significantly lower in the AT+TT genotype than in the AA genotype(both P<0.05).Conclusion AA+AT genotype may be of worse prognosis，however，without significant difference.Rank scoring may reflect the relation between Gleason score and A49T genotype and estimate the prognosis better than two-level discrete evaluation.

　　[Key words] SRD5A2 gene;prostate carcinoma;gene;polymorphism

　　我们通过提取前列腺癌及前列腺增生患者外周血白细胞基因组DNA，并对SRD5A2基因第一外显子进行扩增，用Mwo-1对A49T多态性位点进行酶切鉴定，以了解SRD5A2基因A49T(49密码子苏氨酸替代丙氨酸)多态性与前列腺癌预后因素的联系，并研究基因多态性与前列腺癌、前列腺增生的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 研究对象 2006年3月至2008年12月，我院诊治的前列腺癌患者112例作为试验组，年龄52～86岁，平均70岁，病理活检Gleason评分3分9例，4分9例，5分12例，6分21例，7分31例，8分14例，9分14例，10分2例。临床分期：T1 1例，T2 42例，T3 57例，T4 12例。前列腺增生患者89例作为对照组，年龄49～95岁，平均68岁，所有病例经临床检查、穿刺活检、磁共振成像(MRI)、肛门指检、血游离前列腺特异抗原(PSA)等检查排除前列腺癌。

　　1.2 研究方法

　　1.2.1 外周血白细胞基因组DNA扩增与酶切 从所有112例前列腺癌和89例前列腺增生患者分别取外周血5 ml，利用乙醇提取法提取血基因组DNA。然后参照分子克隆指南并通过聚合酶链反应(PCR)对其第1外显子进行扩增，引物为上游[1]：5′-GCAGCGGCCACCGGCGAGG-3′，下游：5′-AGCAGGGCAGTGCGCTGCACT-3′(试剂购自赛百盛公司)。反应体系：50 μl体系，模板DNA 2 μl(0.1 μg/μ1)，dNTP 2 μl(10 mmol/L)，引物(上、下游)2 μl，Taq酶0.2 μl(5 u/μl )，10×PCR缓冲液5 μl，MgCl2 3 μl(25 mmol/L)，超纯水加至50 μl，1%琼脂糖凝胶电泳，并观察PCR产物的大小(试剂购于Pharmacia公司，美国)，Mwol酶切反应(试剂购于新英格兰公司，美国)，反应体系：20 μl体系，PCR产物4 μl，10×NE缓冲液C 2 μl，Mwol 0.4 μl，超纯水加至20 μl。反应条件：反应体系恒温水浴锅60 ℃，1 h。酶切产物2%琼脂糖凝胶电泳，并观察酶切产物大小，以鉴定AA、AT、TT基因型。三者的碱基分别为AA：90、70、46/47 bp，AT：107、90、70、46/47 bp，TT：107、70、46/47 bp。

　　1.2.2 统计学分析 应用SPSS 13.0软件，对所得数据进行t检验、非参数检验、χ2检验、多因素Logistic回归分析进行统计。

　　2 结果

　　(1)前列腺癌组和前列腺增生组的A49T三种不同基因型(AA、AT、TT)分别为104例(92.9%)、7例(6.25%)、1例(0.89%)和81例(91.0%)、8例(9.0%)、0例。前列腺癌和前列腺增生组的A49T的基因频度分别为0.040，0.045。通过χ2检验我们比较了前列腺癌组、前列腺增生组与A49T分布之间的关系，显示差异均无显著性，两组的A49T分布无区别(χ2=0.047，df=2，P>0.05)。OR比值表明前列腺癌与前列腺增生的A49T基因频度风险无显著性差异(OR=0.779)。(2)前列腺癌组AA与AT+TT基因型与年龄、游离PSA、总PSA的关系：表1示前列腺癌组中AT+TT基因型组发病年龄明显低于AA组(P<0.05)。用非参数检验显示总PSA、游离PSA、游离PSA/总PSA、T分期、Gleason评分在两组间的差异性，结果显示游离PSA、总PSA、F/T、T分期的非参数检验P>0.05，差异无显著性，而AA和AT+TT基因型与Gleason评分差异有显著性。AT+TT基因型Gleason评分平均水平明显高于AA基因型(P<0.05)。(3)应用多因素Logistic回归分析研究肿瘤患者PSA水平，Gleason评分、T分期与AA、AT+TT基因型的相关性。表2示前列腺癌患者PSA≤10、>10，Gleason≤6、>6，T分期≤T2、>T2，年龄≤70岁、>70岁与AA、AT+TT基因型的关系，反映了AA、AT+TT基因型与预后关系情况。PSA≤10、>10时，χ2(df，1)=0.011，OR=1.429，最小理论频数=3.64。Gleason≤6、>6时，χ2(df，1)=2.337，OR=6.236，最小理论频数=3.57。T分期≤T2、>T2时，χ2(df，1)=1.405，OR=4.742，最小理论频数=3.07。年龄≤70、>70时，χ2(df，1)=1.322，OR=0.298，均与两种基因型无相关性，差异无显著意义。但是PSA>10，Gleason>6，T分期>T2时，AA、AT+TT基因型百分比分别为53.8%、61.5%，52.9%、87.5%，59.6%、87.5%。表1 前列腺癌组AA与AT+1Tr基因型与诊断年龄、游离PSA、总PSA关系 表2 AA、AT+TT基因型与PSA、Gleason评分、肿瘤分期及年龄的关系结果表明AT+TT基因型预后较差的百分比有增高趋势。

　　3 讨论

　　前列腺癌是欧美国家老年男性最常见的肿瘤，在美国男性恶性肿瘤中，前列腺癌的发病率居第一位，占所有男性癌症新发病例的25%;病死率居第2位，仅次于肺癌，占所有男性癌症死亡病例的10%[2]。前列腺癌的发病率在不同种族群体和国家之间变化很大，这些差别是多种因素作用的结果，如基因易感性、外部危险因素等[3]。在我国，前列腺癌在泌尿外科仍不算常见恶性肿瘤，前列腺癌的住院患者仅占泌尿外科住院患者的1.5%[4]，随着人们平均寿命的增加、生活水平及医疗诊断技术的提高，近年我国前列腺癌的发病率明显增高[5]。

　　5-α还原酶Ⅱ由SRD5A2基因编码，主要在前列腺和生殖器皮肤中有活性，其定位于2号染色体短臂2p23[6]。目前发现SRD5A2基因中存在10个单核苷酸突变[7]，SRD5A2基因的一个低频率的错译替代发生在该基因的第49密码子，GCC碱基G→A，丙氨酸(Ala)残基由苏氨酸(Thr)替代，即A49T。对于SRD5A2基因A49T多态性与前列腺癌之间的关系目前仍有争议。在白人和西班牙人中进行的研究显示A49T多态性T等位基因与前列腺癌的发生、进展和(或)预后显著相关[6]。上述多态性与5-α还原酶Ⅱ活性相关，从而影响前列腺癌的发病风险。本研究结果前列腺癌组及前列腺增生组的AA、AT、TT基因型与芬兰学者Monomen等[8]的报道结果相似，即前列腺癌组的A49T高于前列腺增生组。可能由于种族差异或样本含量的差异，本研究的百分比略高于上述中关于A49T的基因型6.0%、6.3%的报道。本研究结果还表明，A49T分布在前列腺癌及前列腺增生组中无区别(P>0.05)，测定A49T在两组间的风险比，显示多态性与发病风险相关性不大。在前列腺癌组、前列腺增生组未发现较多TT等位基因，这提示该等位基因有种族差异，抑或与我们的样本量偏小有关。

　　我们的结果显示AT+TT基因型与发病年龄有一定关系，AT+TT组平均发病年龄明显低于AA组。这为将来我们进行前列腺癌的早期筛查提供了一定的理论基础。本研究中AA和AT+TT基因型患者的Gleason评分有显著统计学差异，AT+TT基因型的Gleason评分平均水平明显高于AA型。提示Gleason评分水平改变可能和基因型存在一定关系，AT+TT基因型的Gleason评分水平将增高，对估计预后可能有一定作用。游离PSA、总PSA、F/T、临床分期与AA和AT+TT基因型间无显著性差异，与Monomen等[8]的研究结果相似。本研究显示检测的前列腺癌预后指标均与AA、AT+TT基因型无相关性。提示基因型的多态性与前列腺癌的预后相关性不大，多态性与发病年龄的关系差异也无统计学意义。但是当PSA>10，Gleason>6，T分期>T2时，AA、AT+TT基因型百分比分别为53.8%、61.5%，52.9%、87.5%，59.6%、87.5%。AT+TT基因型预后较差的百分比有增高趋势，提示AT+TT基因型预后较差，但与预后相关性差异无统计学意义。这与Jaffe等[1]关于A49T基因型预后较差的结果不一致，却与Monomen等[8]关于A49T的研究结果相似，该基因多态性与前列腺癌的预后和进展无关。今后对基因多态性的研究还应加大样本量，以便增加统计的效力。上述有关Gleason等级评分与A49T基因型的关系与用分段法评价的研究结果不一致，提示用等级评分法比用分段法更能反映Gleason评分与A49T基因型的关系，并可用来估计预后。

【文献】
  　1 Jaffe AM，Malkowicz SB，Walker AH，et al.Association of SRD5A2 genotype and pathological characteristics of prostate tumors.Cancer Res，2000，60：1626-1630.

　　2 Ahmedin Jemal，Rebecca Siegel，Elizabeth Ward，et al.Cancer statistics 2008.CA Cancer J Clin，2008，58：71-96.

　　3 Gronberg H.Prostate cancer epidemiology.Lancet，2003，361(9360)：859-864.

　　4 Andersson S，Russell DW.Structure and biochemical properties of cloned and expressed human and rat steroid 5-α reductases.Proc natl Acad Sci，1990，87：3640-3644.

　　5 Pu YS，Chiang HS，Lin CC，et al.Changing trends of prostate cancer in Asia.Aging Male，2004，7 (2) ：120-132.

　　6 Makridakis N，Ross RK，Pike MC，et al.Association of missence substitution in SRD5A2 gene with prostate cancer in African-American and Hispanic men in Los Angles.USA.Lancet，1999，8：975-978.

　　7 Makridakis NM，Di Salle E，Reichardt JK.Biochemical and pharmacogenetic dissection of human steroid 5 alpha-reductase typeⅡ.Pharmacogeneties，2000，10(5)：407-413.

　　8 Monomen N，Ikonen T，Syrjakoski K，et al.A missence substitution A49T in the steroid 5-α reductase gene (SRD5A2) is not associated with prostate cancer in Fanland.Br J cancer，2001，(2)：1344-1347.