不同低温冷冻预处理对异体神经移植再生影响的实验研究
【摘要】 目的 观察不同冷冻温度下保存的异体神经对周围神经缺损修复的效果。方法 取96只同种属雄性大鼠，其中24只为取材组，72只随机分为对照组（A、B组）和实验组（C、D、E、F组），每组12只。A组为新鲜自体神经移植组,B组为新鲜异体神经移植组,C、D、E和F组分别为经4℃、-50℃、-80℃和-196℃甘油保存3周的神经移植组。术后2周，进行免疫组织化学观察；术后9、16周进行大体观察、光镜检察、电生理测定。结果 术后2周， B组移植段见明显T淋巴细胞浸润，C、D、E组次之，A组及F组未见T淋巴细胞。术后9周及16周，从神经再生效果评价看：A组神经再生效果最好， F组次之，C、D、E组再次，B组最差。结论 在各冷冻组中，以 -196℃组神经再生效果最好，接近新鲜自体神经移植组。
【关键词】 低温 神经移植 周围神经 预处理
Abstract： Objective To investigate the regeneration of peripheral nerve allografts stored in the glycerol of different temperature.Methods A total of 96 male Wistar rats,were randomly divided into 7 groups.Group A and B were the control groups,each of which included 12 rats;all underwent fresh femoral nerve autograft and allograft transplantation respectively.Twenty?four rats in group G were sacrificed to obtain 48 femoral nerves,which were randomly divided into 4 groups,12 nerves in each group,and were stored in glycerol for 3 weeks at 4℃, -50℃, -80℃ and -196℃ respectively.After storage for 3 weeks,4×12 nerves in each temperature group were randomly transplanted into 4×12 rats in target rats group C,D,E and F respectively.Two weeks after transplantation, two grafts of transplanted nerves in group A～F were harvested randomly and examined with immunohistochemistry to observe the infiltration of lymphocyte to the grafts and regeneration of sciatic nerve and fiber.Nine and 16 weeks after transplantation,the regeneration of sciatic nerve was examined with histology,electro?physiology and with electron microscope.Results Wallerian degeneration was observed in the proximal and distal ends of all grafts of nerves harvested at 2 weeks post?engraftment; infiltration of T lymphocytes at the grafts in group B was significant,less T lymphocytes were seen in group C,D and E,while no T lymphocytes were seen in group A and F.Collagenoblast proliferation was observed in group B,Schwann cell proliferation in group A and F,while both collagenoblast and Schwann cell proliferation were observed in group C,D and E.Nine and 16 weeks post?engraftment,grafts in group B were severely adhered to the adjacent tissue,adherence in group A and F were slight,while that of groups C,D and E came between.Nerve regeneration of group A was the best,group F came second,the next were groups C,D and E,while group B was the worst.Conclusion The best storage temperature is -196℃.
Key words：hypothermia;nerve allograft;peripheral nerve;pretreatment
周围神经缺损的修复，尤其是对长段神经干缺损的修复，其处理仍为临床上较棘手的问题。自体神经移植被公认为是修复神经缺损的最佳选择，但自体可供移植的神经来源有限、还会给供区带来功能损害，临床应用受到一定的限制。如何找到一种或者几种合适方法的联用，有效降低移植神经的免疫原性、增加神经纤维的再生能力，将对临床上异体神经移植的常规开展起到积极的作用。目前效果较为肯定的预处理方法是低温冷冻，而保存在怎样的冷冻条件下效果最好，同样是我们所关注的。本研究的目的是用甘油做保存液，观察在不同冷冻温度下保存的异体神经对周围神经缺损修复的效果，以探求出最佳的冷冻温度。
材料与方法
1 动物与分组
健康同种属雄性Wistar大鼠96只，月龄2月以上，体重（300±20）g。其中24只为取材组，72只随机分为对照组（A、B组）和实验组（C、D、E、F组），每组12只。A组为新鲜自体神经移植组,B组为新鲜异体神经移植组,C、D、E和F组分别为经4℃、-50℃、-80℃和-196℃甘油保存3周的神经移植组。
2 主要仪器及试剂
显微手术器械，冰箱（容声，广东）,双目显微镜（奥林巴斯，日本）,病理组织包埋台（BMZ?Ⅲ型，苏州）,超薄切片机（Rechert Ｕltracut E型，德国）,显微镜（H-600，日本）,肌电检测仪（KEY point V 3.22，Medtronic，美国）,小鼠抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体(英国Serotec公司),兔抗人GAG单抗(美国SantaCruz公司) ,生物素标记的兔抗大鼠血清(美国Sigma公司) 。
3 方法
3.5%水合氯醛1ml/100g腹腔麻醉。在大鼠股后外侧行纵行切口；从梨状肌孔下0.5cm处，用消毒剃刀片，切取神经干1.0cm。取材组：取24只大鼠双侧坐骨神经干取下1.5cm长，本实验4组(4×12)神经，置于37℃条件下，依次浸泡于50%、70%和85%的甘油中各3小时，再分装在盛有85%甘油EP管中密封，分别置于4℃、-50℃、-80℃冰箱与-196℃液氮瓶中（采用分阶段降温措施，降温速度1～1.5℃/min），保存时间均为3周。对照组A：将坐骨神经取下后立即移植给自体的对侧；对照组B：将坐骨神经取下后不作任何处理，立即相互交叉移植作为新鲜异体神经移植。实验组C、D、E、F组：分别在3周后在随机原则下将各组12条神经分别移植给12只大鼠。
4 观察指标
大体观察；术后2周每组取2只大鼠做小鼠抗大鼠CD4和CD8单克隆抗体双标免疫组化；术后9周及16周，每组随机抽取5只，做以下检测指标：组织学切片光镜、神经电生理、透射电镜。
5 统计学分析
所有数据以均数±标准差表示，用SPSS统计软件处理，采用q检验，P＞0.05视为无统计学差异。
结果
1 大体观察
术后2周，大鼠各实验足趾开始出现红肿，溃疡及糜烂；术后4周，大鼠实验趾脱落，其中足趾脱落情况以自体移植A组最轻，实验F组次之，B组最重；术后9周，A、F组溃疡已愈合，C、D、E组仍可见小溃疡且红肿明显，B组深大溃疡仍存在，肌肉萎缩明显；术后16周，A、F组已恢复近正常功能，C、D、E组无溃疡，已恢复部分后蹬动作，B组浅溃疡红肿存在，拖足行走。
2 各组取材时移植体情况
术后2周取材见：A组近端肿胀，远端神经吻合口为少量结缔组织包裹，再植神经段色白，表面有少量毛细血管；其余各组移植体周围黏连明显，结缔组织包裹，再植神经段色白，表面未见毛细血管生长；B组黏连情况最重，F组情况略好，但仍重于A组。术后9周取材见：A组再植神经段近端肿胀轻，远端吻合口与周围组织黏连轻，再植神经段色白，表面有大量毛细血管，呈网状。F组情况与A组相近，B组再植神经段近远端吻合口与周围组织黏连重，再植神经段大部分为纤维组织包绕。其余各组情况介于F组与B组之间。术后16周取材见：A组与F组情况很相近：再植神经段近端接近正常，远端吻合口与周围组织仅有少量细丝样黏连，再植神经段表面有大量毛细血管（图1）。B组情况最差，神经移植体部分为纤维组织替代，与周围组织黏连在一起，再植神经段无毛细血管生长。C、D、E组情况介于F组与B组之间。
3 免疫组化观察
术后2周， CD4/CD8双标免疫组化结果：A组成纤维细胞较少，SC多，分布于变性神经纤维周围，排列规则，Wallerian变性明显，未见T淋巴细胞浸润；B组 Wallerian变性明显，成纤维细胞很多，SC较少（图2）每个视野均可见数个CD4/CD8T细胞亚群的浸润（棕色受染近圆形核）；C组成纤维细胞增生可见，SC增生可见，排列较规则，Wallerian变性可见，偶可见散在单个CD4/CD8T细胞亚群的浸润；D，E组结果基本同C组；F组成纤维细胞少，SC增生明显，排列规则，可见数个典型沿变性神经纤维周围分布的“圈”，Wallerian变性明显（图3），均未见T淋巴细胞浸润。
4 光镜观察
术后9周，取各组大鼠5只在200倍视野下见：A组移植段血管增生，有髓神经纤维很多，SC增生很明显，排列较规则，轴索变性，髓鞘溶解可见，淋巴细胞浸润不明显；B组移植段有髓神经纤维少，SC可见，轴索变性，髓鞘溶解非常明显，见淋巴细胞浸润明显；C组移植近端，有髓神经纤维较少，SC增生较明显，轴索变性，髓鞘溶解明显，淋巴细胞浸润不明显；D和E组同C组相似；F组移植段近端，有髓神经纤维多，SC增生很明显，轴索变性，髓鞘溶解可见，淋巴细胞浸润不明显（图4）。
5 电镜观察
神经移植术后9周，取各组大鼠2只，取移植体近端0.5cm送透射电镜检查，各组均见神经纤维再生：A组再生纤维数量多，髓鞘成熟，发育完善，髓鞘旁可见SC，轴浆均匀，丰富；B组再生纤维数极少，Wallweian变性严重，轴浆萎缩明显，几乎不能见；C组再生纤维数量较多，Wallerian变性可见，较广泛，轴浆萎缩较明显；D和E组与C组相近；F组再生纤维数量较多，髓鞘较成熟，发育完善，髓鞘旁可见少量SC及髓鞘互相包绕影，轴浆较均匀（图5），与A组相近。
6 神经电生理测定
术后9周统计分析：A组与B、C、D、E组相比，P<0.05，表明有统计差异性;F组与B、C、D、E组相比，P<0.05，有统计学意义。结合F组潜伏期较短，传导速度快，可见F组再生神经功能优于B、C、D、E组（见表1）。
术后16周统计分析：A组与B，C，D，E组相比，P<0.05，有统计学意义;F组与B，C，D，E组相比，P<0.05，有统计学意义;A组与F组相比，P>0.05，两组间差异无统计学意义。即术后16周，A、F组在潜伏期和传导速度上非常接近，再生神经功能接近（见表2）。
表1 术后9周各组再生神经传导速度及潜伏期结果（略）
表2 术后16周电生理各组再生神经传导速度及潜伏期结果（略）
图1 F组16周移植体情况（略）
图2 B组移植体近端横切面形态结构（免疫组化×400，2周）（略）
图3 F组移植体近端横切面形态结构（免疫组化×400，2周）（略）
图4 F组移植体近端横切面形态结构（HE×200，9周）（略）
图5 术后9周F组扫描电镜图(×3500)（略）
讨论
1 免疫排斥反应与雪旺氏细胞
现在，较多的证据已表明异体神经移植物中的主要抗原成分大多存在于细胞成分中，在移植免疫学中，这种细胞是指移植物中可递呈抗原并表达主要组织相容性复合体（MHC）分子、激活异种抗原识别的细胞，在周围神经中则主要是雪旺氏细胞(Schwann cell，SC)。SC是排斥反应的主要目标，具有加工外源性抗原的能力，表达MHC?Ⅱ抗原；而且SC还可产生淋巴因子，如干扰素（INF?r）、肿瘤坏死因子（TNF?α）、白介素(IL?1，IL?12)，激活巨噬细胞的功能，直接参与排斥反应。SC能产生神经生长因子(NGF)，这类神经营养因子对伤后神经的再生有重要作用。本实验各实验组在术后2周行免疫组化检察，可清晰见到B组T淋巴细胞的浸润；A、F组未见到T淋巴细胞；C、D、E组单个视野偶尔可见单个T细胞。经深低温预处理的F组（-196℃组）抗原性明显减低，更利于宿主SC细胞再生。移植后9周的电生理结果显示：F组（-196℃组）潜伏期为（1.3105±0.0291）毫秒，神经传导速度为（13.0223±0.9529）m/s，与C、D、E组相比有显著性意义（P<0.05）,即F组优于C、D、E组，术后9周光镜及电镜结果也得到同样的结论。术后16周电生理结果显示A组与F组在潜伏期和传导速度上非常接近，再生神经功能无统计学差异。
2 常用保存液有以下几种
近年来国内外学者常用的异体神经保存液有：绿茶多酚［1］(green tea polyphenols,GTPs) ，冷冻血浆，乙醇，甘油等。甘油作为同种异体神经移植的预处理液有如下优点：制作简便，保存方便，费用低廉，并可长期保存。国内学者［2］实验证实经甘油预处理的异体神经，其抗原性能显著降低。机制是：逐级将神经脱水，不仅能破坏SC从而降低其免疫原性，而且能完好的保存神经内的SC基膜管，使其不致皱缩、变形，为再生神经纤维提供良好的通道。同时85%甘油有很好的灭菌作用，能预防感染发生。本实验4组(4×12)神经，置于37℃条件下，依次浸泡于50%、70%和85%的甘油中各3小时，再分装在盛有85%甘油EP管中密封，分别置于4℃、-50℃、-80℃与-196℃液氮瓶中（分阶段降温，降温速度1～1.5℃/min），较好的保持了冻存细胞的活力和功能，保存3周后行神经移植。且术后实验各组大鼠无1例感染，也说明了经甘油预处理后的移植神经能有效预防感染。
3 冷冻损伤
低温冻存是保存活体组织的重要方法，冷冻损伤是活体组织细胞经冷冻后最重要的副反应。损伤机制主要是冻融时冰晶对细胞的机械性和渗透性损伤，表现在以下两个方面［3］：（1）慢速冷冻过程中，细胞外液水分不断结晶造成游离水分减少，导致细胞内外渗透压不等，使得大量水分由细胞内向细胞外渗出，逐渐导致细胞内渗透压升高，造成“溶质性损伤”。（2）快速冷冻过程中，细胞内水分尚未转移到细胞外，而细胞内外同时结冰，细胞内冰晶机械性破坏细胞器和细胞核而导致细胞损伤，造成“细胞内冰晶损伤”。目前认为生物组织的冷冻损伤主要是“溶质性损伤”所产生的渗透压、电解质含量和pH值的改变作用于细胞膜脂质造成的细胞膜渗漏，在复温过程中，细胞膜渗漏使大量水分进入细胞内导致细胞水肿而死亡，称为渗透性休克［4］。此外，复温过程中如复温速率较慢，则会再次形成冰晶，加重细胞损伤。由于冷冻速率越快引起细胞内冰晶形成越多，而速率过慢又可导致“溶质性损伤”。因此，低温保存需要选择造成损伤最轻的降温速率。此外，复温速率对低温保存后细胞活力的恢复有很大影响，严格说复温过程是降温过程的逆函数。如果没有足够快的复温速率，细胞内再次形成冰晶的概率很高。为了减轻冷冻损伤，选择适宜的降温和复温速率是低温保存的一个关键环节。分阶段降温比匀速降温对细胞活力和功能影响小，因此本实验采用分阶段降温措施，降温速度1～1.5℃/min［5］，冷冻时间以3周为宜［6］，3周后于37℃水箱中快速复温，较好的保持了冻存细胞的活力和功能。
冷冻保存异体神经有降低其免疫原性的作用；在各冷冻组中，以 -196℃组神经再生效果最好，接近新鲜自体神经移植组。
【】
［1］Ikeguchi R,Kakinoki R,Matsummoto T,et al.Peripheral nerve allografts stored in green tea polyphenol solution［J］.Transplantation,2005,79(6):688-695.
［2］刘金慕,彭吴,王志林.甘油处理的同种异体神经在临床的应用［J］.临床外科杂志，2002,10(4):227-228.
［3］Brien FJ,Harley BA,Yamtas IV,et al.Influence of freezing rate on pore structure in freeze?dried collagen?GAG scaffolds［J］.Biomaterials，2004,25(6):1077-1086.
［4］Windntm P,Morris TC,Drake MB,et al.EBMT chronic leukaemia working party complications subcommittee. variation in dimethyl sulfoxide use in stem cell transplantation: a survey of EBMT centres［J］.Bone Marrow Transplant,2005,36(7):601-603.
［5］Kotobuki N,Hirose M,Machida H,et al.Viability and osteogenic potential of cryopreserved human bone marrow?derived mesenchymal cells［J］.Tissue Eng,2005,11(5-6):663-673.
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