活性炭对酥梨汁色素的吸附研究

　　3生物工程改造育种
　　
　　生物工程改造育种是随着生物技术的发展,尤其是细胞生物学、分子生物学、基因扣作等学科的发展而兴起的育种方式。本文主要从原生质体融合和基因工程育种2个方面对生物工程改造育种进行阐述。
　　3.1原生质体融合
　　微生物原生质体融合技术具有重组频率高、受结合型或致育型限制小以及遗传物质传递完整等优点。通常使用机械法或酶法去除细胞壁制备原生质体,之后在合适的条件下进行人为的诱导融合,采用营养缺陷型、抗药性、灭活标记或荧光染色标记进行融合子的筛选。应用原生质体融合技术可以有效地提高代谢产物的产量和质量;改良菌种的遗传特性,获得新的代谢途径和性状[25]。
　　原生质体融合中的关键环节在于原生质体的再生,刘金艳等[26]研究了玫瑰黄链霉菌Men-myco-93-63原生质体形成和再生条件,通过培养基选择、培养时间、甘氨酸浓度、溶菌酶浓度、酶解时间等条件选择和优化,成功获得了原生质体,为转化、基因表达奠定了基础。王记侠等[27]运用原生质体融合技术将重寄生链霉菌F46与生防链霉菌SC1融合,筛选出的融合子对灰葡萄孢的抑制作用提高了27.99%。陈芝等[28]对2株阿维链霉菌(阿维菌素高产株76-05和仅产阿维菌素B不产寡霉素的基因工程菌73-12)进行了原生质体融合,选育出仅产阿维菌素B不产寡霉素的高产菌株。原生质体去除了细胞外壁,仅保留脆弱的细胞膜,因而对各种诱变因素的敏感性强,正突变率高,但是需要解决原生质体再生的条件优化。
　　3.2基因工程育种
　　由于产抗生素的链霉菌遗传结构包括抗生素生物合成、抗生素抗性、氨基酸生物合成、色素生成和发育变化等方面的不稳定,大大制约了链霉菌的工业化生产。许多科研工作者将基因工程技术运用到了链霉菌育种之中,这包括:利用基因阻断、敲除、替换等突变技术了解基因的功能、表达、调控,进而进行抗生素的修饰、改造;采用各种基因操作技术,使不同化合物、不同来源的基因在同一菌株中重新组合,增加代谢产物的多样性[3];利用基因筛选程序,筛选含有特定类型化合物的基因产生菌,进而获得了相应的次生代谢产物[29];利用基因组重排技术对出发菌株进行处理[30]等。
　　基因组重排是以整个基因组为操作对象的一种DNA重排。其本质就是进行多次的原生质体的融合和再生。美国的Zhang首次提出了这一概念,并应用此技术提高了费氏链霉菌合成泰乐星的能力[30]。徐波等[31]人应用基因组重排育种方法筛选替考拉宁高产菌,其替考拉宁的产量从原始菌株的1 825 μ/mL提高到了3 016 μ/mL,增长了65.3%。徐波等[32]将普那霉素产生菌始旋链霉菌的孢子和原生质体经紫外诱变后的高产突变株进行了4轮基因组重排育种,筛选出的重排菌株普那霉素产量为832 mg/mL,比原始出发菌株提高了206%。
　　通过基因组测序分析,已经发现在链霉菌基因组中大多数情况是生物合成基因以相近的簇形式存在[33],单拷贝可扩增因子通过速率限制不对称交换以转换成重复结构。组建重组子的可扩增因子和重要基因的拷贝数,也可能提高基因产物的表达量[34]。ccaR蛋白对棒状链霉菌中克拉维酸的合成具有正调控作用,由ccaR基因编码,白小佳等[35]通过增加ccaR基因剂量提高了棒状链霉菌克拉维酸的产量,突变株的产酸量是出发菌株的1.54倍。
　　将生物合成基因与相应的质粒载体重组,导入特定的基因工程菌,由于质粒的高拷贝,诱导表达获得高产量的抗生素。高慧英等[36]对吸水链霉菌17997建立了噬菌体基因转移系统,利用基因阻断技术筛选出了与格尔德霉素生物合成相关基因的柯斯质粒,从而为格尔德霉素的生物合成基因簇的克隆奠定了基础。张红莲等[37]从橄榄绿链霉菌A1中克隆出了木聚糖酶基因xynA,将其与大肠杆菌表达载体pET-22b(+)构建重组子,在重组大肠杆菌中木聚糖酶得到表达,摇瓶培养的表达量达到200 mg/L。随着生物技术的不断发展与进步,尤其是DNA体外重组技术、各种基因工程表达宿主和表达载体的构建和完善,对于链霉菌功能基因的研究越来越深入,功能基因的合成,基因工程菌的改造正逐渐在育种领域发挥出巨大的作用与潜力,逐渐成为链霉菌育种的主流方式。
　　
　　4复合诱变育种
　　
　　复合诱变育种是指采用2种或者2种以上的方式进行诱变育种。通过不同的方式作用于微生物菌株的协同效应,可以改变菌株的突变率,从而提高获得理想菌种的几率。通常采用物理方式、化学方式和生物工程育种两两结合或三者同时运用。
　　余明洁等[38]以白色链霉菌SA为出发菌株,采用紫外照射复合氯化锂诱变选育及亚硝酸诱变选育,得到1株具有遗传标记AEC的抗性突变高产菌株,摇瓶发酵培养ξ-聚赖氨酸产量高达1.64 g/L,较出发菌株提高了57.7%。张建勇等[39]筛选出1株产抗肿瘤活性新抗生素AGPM的藤黄灰链霉菌,经过紫外单因子诱变,紫外线加氯化锂复合诱变等2种诱变方式处理后,AGPM的产量达到18.7 μg/mL,较出发菌株提高了1.2倍。研究还发现,孢子经氯化锂浸泡后,对紫外线的敏感性明显增加,可能是因为氯化锂本身并没有诱变作用,但是复合育种过程中与其他诱变因子具有协同作用,从而导致突变率的增加。
　　由于不同方式的诱变对链霉菌的DNA作用位点和作用方式的差异,反复使用同种类型的诱变方法可能会出现钝化现象,从而导致链霉菌的回复突变,影响育种效果。因而在链霉菌育种过程中,要尽可能地采用新的育种方式或多种不同的育种方式进行,以提高成功的可能性。
　　
　　5结语
　　
　　物理因素诱变育种、化学诱变育种、生物工程育种,反映出链霉菌育种方法随着科学进步而不断发展的历史。物理和化学诱变育种,虽然有一定的弊端,比如说样本量巨大、筛选过程繁琐等,但是同样具有简单、易行、安全、遗传稳定的优点,仍然是链霉菌育种中不可或缺的育种方法。如采用物理化学因子对原始菌株进行诱变处理后筛选耐药性突变株,通过摇瓶发酵复筛可以选择高产菌株,从而达到淘汰野生型菌株、富集突变型菌株的目的,大大减轻了初筛的工作量,有效地提高了工作效率。生物工程育种则代表这链霉菌育种的发展方向,随着生物学的发展,遗传重组育种、基因表达调控育种、基因工程育种应运而生,并逐渐成为链霉菌育种工程的主流方法。
　　复合诱变育种,则更多的体现了将各种育种方法进行有机的结合,从而实现有效的互补,最大限度的发挥育种的优势。生物工程育种中,抗性基因、生物合成基因、功能基因的克隆和改造能够直接大幅度的提高抗生素的产量,结合物理和化学诱变方法,获得遗传稳定的高产菌株,对链霉素工业化生产起着举足轻重的作用。
　　在现有阶段,充分发展生物工程育种,发挥复合诱变育种的组合优势,同时不断开发新的育种方法,已经成为链霉菌育种的发展趋势。随着相关学科的不断发展与进步,链霉菌育种方法将会越来越完善。
　　
　　6参考文献
　　[1] 陈毅坚,高旭红,付翠花.一株放线菌次生代谢产物化学成分的研究[J].生物技术,2007,17(5):50.
　　[2] 徐丽华,李文均,刘志恒,等.放线菌系统学、原理、方法及实践[M].北京:科学出版社,2007.
　　[3] 杨颖,姜怡,尹敏,等.放线菌此生代谢产物合成基因组研究[J].微生物学杂志,2007,27(6):68.