银杏叶提取物对老化红细胞膜ATP酶、SOD和MDA影响

【摘要】  目的 观察银杏叶提取物（EGb761）作用下老化红细胞膜三磷酸腺苷酶（ATPase）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）含量的变化，探讨EGb761抗衰老的机制。方法 采用恒温水浴箱孵育法模拟红细胞的自然衰老过程，观察EGb761对老化红细胞膜MDA含量、SOD和ATPase活性的影响。结果 与衰老组比较，EGb761组的红细胞MDA含量明显降低，SOD、ATPase活性明显升高，差异有极显著意义（t=2.02~70.06，P<0.05、0.001）。结论 EGb761能提高红细胞的抗氧化能力，保护红细胞膜蛋白，减缓红细胞的老化过程。 
【关键词】  银杏叶提取物 红细胞膜 超氧化物歧化酶 丙二醛

［ABSTRACT］ObjectiveTo observe the effects of Ginkgo biloba extracts (EGb761) on erythrocyte survival, and explore the protective mechanism of EGb761 on erythrocyte.MethodsAfter 24 hours’ incubation in thermostatic waterbath, the concentration of the product of erythrocyte lipid peroxidation-malondialdehyde (MDA) and the activity of superoxide dismutase (SOD) and ATPase in RBC were measured.ResultsCompared with the aging group，EGb761 could significantly decrease the erythrocyte MDA concentration and improve the activity of SOD and ATPase (t=2.02-70.06;P<0.05,0.001).ConclusionEGb761 can directly resist the erythrocyte membrane lipid peroxidation injury from aging.
    ［KEY WORDS］Ginkgo biloba extracts; Erythrocyte membrane; Superoxide dismutase; Malondialdehyde
    近年来，国内外对于银杏叶提取物(EGb761)进行了全方位的研究，关于其主要活性成分银杏叶黄酮和银杏内酯的药理作用研究已卓有成效，其对心脑血管和中枢神经系统的保护作用已得到各国医学界的认可［1］。其中内酯的PAF特异性受体拮抗作用和黄酮类化合物的抗氧化及自由基清除作用近年更受学者们的青睐，是人们关注的焦点［2~4］。本文采用37 ℃恒温水浴箱孵育法模拟红细胞的自然衰老过程，观察EGb761对老化红细胞脂质过氧化产物丙二醛（MDA）浓度、红细胞超氧化物歧化酶（SOD）和红细胞三磷酸腺苷酶（ATPase）活性的影响，以探讨EGb761在体外对脂质过氧化损伤引起的红细胞老化的影响及其减缓红细胞老化的机制。
    1  材料与方法
    1.1  材料
    紫外线分光光度计UV-260由CO-PARMEK USA生产；银杏叶提取物（商品名金纳多针剂，内含EGb761）由德国威玛舒培博士药厂生产；电热恒温水浴箱由北京医疗设备厂生产；磷酸盐、Na2EDTA等均为国产分析纯试剂；JSM-840扫描电镜、JEM-1200EX透射电镜由日本JEOL公司生产。
    1.2  方法
    1.2.1  老化红细胞制备  取40例年龄20~61岁的健康成年人肘静脉血，肝素抗凝,4 ℃下2 500 r/min离心5 min,除去血浆和灰白色的白细胞层。按1∶2 左右的比例加入PBS磷酸盐缓冲液（磷酸盐5 mmol/L，氯化钠150 mmol/L，pH 7.40）, 混匀后2 500 r/min 离心5 min，吸去上清液及白细胞层,换洗、离心,重复3次,最后加PBS磷酸盐缓冲液配成体积分数为0.05（红细胞计数为5.56×1013/L）的红细胞悬液。实验分成3组：对照组、单纯衰老组、EGb761保护组。
    1.2.2  红细胞膜ATPase、SOD活性及MDA含量的测定  采用南京建成生物工程研究所提供的ATP酶试剂盒进行检测。
    1.3  统计学处理
    实验数据均以x±s表示，采用PEMS医学统计学软件对样本均数进行t检验。
    2  结    果
    模拟红细胞的自然衰老过程，37 ℃孵育24 h后，单纯衰老组红细胞在老化作用下SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活性均明显降低，MDA含量明显增高，与对照组红细胞相比差异有显著性（t=24.17～116.98，P<0.05）。EGb761保护组衰老红细胞的SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase活性与单纯衰老组相比显著升高，差异有统计意义（t=60.06～75.11，P<0.05），但显著低于对照组（t=15.33～49.33，P<0.05）；红细胞MDA含量与单纯衰老组相比明显降低，差异有统计意义（t=30.19，P<0.05），但仍高于对照组（t=11.68，P<0.05）。见表1。 表1  EGb761对自然衰老红细胞MDA、SOD、Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase的影响
    3  讨    论
    哺乳动物的红细胞是研究细胞老化的很好模型，这是因为：①红细胞十分容易得到、分离和纯化；②红细胞无蛋白合成功能，不可能对损伤进行修复，也没有新合成蛋白质嵌入的影响；③红细胞膜是其惟一的质膜，分离时不易造成污染，同时其又是红细胞唯一的细胞器，因此用红细胞研究与年龄相关的变化十分有利；④红细胞直接暴露在氧高分压下，又有铁离子催化，特别易受脂质过氧化的损伤。
    自由基对生物细胞膜损伤的主要方面是产生脂质过氧化物,其中最重要的是MDA。MDA是氧自由基与红细胞膜多聚不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的继发性产物，是自由基对生物细胞膜损伤的最终产物,具有很强的生物毒性, 其产生量与氧自由基的量相平行，MDA 含量增多,可造成膜损伤，影响红细胞变形性。
    生理状态下,红细胞内及血浆中存在着一整套清除自由基的酶类和非酶类抗氧化剂,使体内自由基产生和清除处于动态平衡。SOD是红细胞和机体内重要的抗氧化酶和自由基清除剂，能够有效地清除体内自由基, 保护红细胞及机体免受损伤，对红细胞和机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用。
    成熟红细胞为了适应其运行至全身微血管的需要，除了依靠它较强的变形能力外，还要依靠多种酶来完成其能量代谢。ATP酶是红细胞能量代谢重要的酶，它在物质运送、能量转换以及信息传递方面具有重要的作用。它能维持膜两侧的渗透压平衡，防止水钠潴留，具有主动转运钠、钾离子的功能。而Ca2+-ATP 酶主要维持红细胞内Ca2+的主动转运。ATP酶活力的高低是红细胞能量代谢及功能有无损伤的重要指标。
    研究表明,老化红细胞膜的Na+，K+-ATPase和Ca2+，Mg2+-ATPase 酶活力随其年龄增长而降低。随年龄增长,红细胞膜Na+，K+-ATPase 酶合成量下降,以至Na+、K+离子从膜两侧的转移率下降,导致机体能量代谢低下。自由基损伤对其有抑制作用,大量的Ca2+进入细胞内,使细胞内游离Ca2+的增加,激活膜磷脂酶,使膜磷脂分解,致使膜对Ca2+的通透性进一步增加,又加剧了Ca2+内流,导致Ca2+超载。Ca2+超载一方面直接引起线粒体损伤,又可使细胞内Ca2+调节的生化反应发生紊乱,激活许多降解酶,进一步导致细胞死亡。