卡维地洛抗动脉粥样硬化作用的研究
【摘要】 目的 探讨卡维地洛在动脉粥样硬化病变中的抗氧化作用及其对增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFκBp65）活化的影响。方法 雄性新西兰大耳白兔24只，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组8只，共计喂养10周。实验结束后，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清超氧化物歧化酶（SOD），硫代巴比妥酸比色法检测丙二醛（MDA）,并采用免疫组化的方法测定血管壁PCNA及NFκBp65的表达。结果 高脂组和卡维地洛组血清三酰甘油和胆固醇较正常组明显升高（F=146.25、287.83,q=14.76～20.75,P<0.01），而该两组间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P>0.05）。高脂组较正常组SOD明显降低，MDA明显增加，而卡维地洛组较高脂组SOD有所升高，MDA有所降低（F=21.65、75.64,q=4.98～24.29,P<0.01）。高脂组PCNA和NFκBp65的表达较正常组明显增加，卡维地洛组PCNA和NFκBp65的表达较高脂组明显减少（F=426.12、521.38,q=56.15～75.87,P<0.01）。PCNA和NFκBp65的呈正相关（r=0.975，P<0.01）。结论 卡维地洛有减轻脂质过氧化损伤的作用，可阻断NFκB的活化，进而抑制平滑肌细胞的增殖。
【关键词】 动脉硬化 卡维地洛 抗氧化剂 细胞增殖 兔
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of carvedilol on antioxidation and activation of PCAN and NFκB on atherosclerosis.MethodsTwentyfour male New Zealand white rabbits were randomly divided into three groups: normal group, highfat diet group and cavediloltreated group, with eight rabbits in each group. All the rabbits were fed for 10 weeks. After completion of the experiment, the levels of serum triglyceride and cholesterol were measured by enzymatic method, of serum SOD by xanthine oxidative technique, and of serum MDA by thiobarbituric acid method. Expression of the PCAN and NFκBp65 in the vascular wall was detected immunohistochemically. ResultsCompared with those of normal rabbits, the levels of serum triglyceride and cholesterol of the highfat diet and cavediloltreated were extremely high （F=146.25，287.83； q=14.76-20.75； P<0.01), but no statistical difference was found between the latter two groups （q=0.53，0.59; P>0.05). Lowlevel serum SOD and highlevel serum MDA were noticed in highfat diet rabbits. In highfat diet group, SOD was lower than that in normal group, and MDA was higher; in cavediloltreated group, SOD was higher, and MDA was lower as compared with normal group （F=21.65，75.64; q=4.98-24.29; P<0.01）. The expression of PCNA and NFκBp65 in highfat diet group was markedly increased as compared with the normal group; but the expression was decreased in carvedilol group as compared with highfat diet （F=426.12，521.38; q=56.15-75.87； P<0.01）. An analysis showed that a positive correlation existed between PCNA and NFκBp65. Conclusion Carvedilol might relieve the lipid peroxidation injury and block NFκB activation so as to inhibit the proliferation of smooth muscle cells.
［KEY WORDS］ atherosclerosis; carvedilol; antioxidants; cell proliferation; rabbits
动脉粥样硬化(AS)是许多心脑血管疾病的基础性病理表现,也是中老年人常见疾病之一，严重威胁着人类的健康。氧化损伤是AS病变过程中核心环节，而平滑肌细胞的迁移增殖是斑块形成、管腔狭窄的直接原因。卡维地洛是具有多种药理活性的第三代β受体阻滞剂，除具有非选择性β受体阻滞作用外，还有α1受体阻断作用。近年来的研究表明，卡维地洛具有较强的抗氧化作用，这使其在抗AS病变中具有重要意义。本实验通过高脂饮食加免疫损伤内皮的方法诱发家兔AS模型，观察卡维地洛对AS病变过程中脂质过氧化损伤、增殖细胞核抗原（PCNA）及核因子kappaBp65（NFκBp65）表达的影响，进一步阐述其抗AS作用机制，从而为临床治疗AS提供依据。
1 材料与方法
1.1 药物和试剂
卡维地洛（金洛）由齐鲁制药有限公司提供，批准文号：国药准字H20000100；超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物工程研究所；PCNA和NFκBp65及相关SP试剂盒购自武汉博士德生物工程研究所。
1.2 主要仪器
上海精密仪器厂721型分光光度计，美国Lambert公司石蜡切片机，日本Olympus公司显微照相装置，德国欧波同公司VIDAS 21图像分析系统。
1.3 实验动物分组
健康雄性新西兰大耳白兔24只（购于华中科技大学同济医学院实验动物学部，合格证号：医动字第19025号），体质量（2.50±0.25）kg，分笼饲养，随机分为正常组、高脂组、卡维地洛组，每组8只。
1.4 模型的制备及药物干预
家兔适应性喂养1周后，高脂组和卡维地洛组均一次性经耳缘静脉注射牛血清清蛋白250 mg/kg，然后均行高脂饮食。高脂饲料配方为：1 g胆固醇+5 g猪油+94 g普通饲料。另外，卡维地洛组每日清晨行卡维地洛10 mg/kg灌胃。正常组行普通饲料喂养（100 mg/d）。各组家兔共喂养10周。
1.5 血液标本的采集及测定
喂养10周后，各组动物分别行250 g/L乌拉坦（4 mL/kg）腹腔麻醉，沿胸骨正中线纵向剖开胸腔暴露心脏，直视下行右心室穿刺抽血，酶法检测各组家兔的血清三酰甘油及胆固醇，黄嘌呤氧化法检测血清SOD，硫代巴比妥酸比色法检测MDA，各操作步骤严格按说明书进行。
1.6 局部病理标本的取材及检测
全血采集完毕后气胸处死动物，游离主动脉至髂总动脉分叉处，仔细清除血管壁脂肪及结缔组织，纵向剖开血管壁暴露内膜表面，铺平。高脂组、卡维地洛组在主动脉弓病变处取材，大小约1.0 cm×0.5 cm，正常组亦在主动脉弓处取材，其大小也约1.0 cm×0.5 cm，分别放入100 g/L中性多聚甲醛中固定，并逐步脱水，透明，浸蜡，包埋制成蜡块。每一标本连续切片两张，分别行PCNA及NFκBp65免疫组化检测，免疫组化采用SP法，DAB显色，操作步骤严格按照说明书进行。
PCNA及NFκBp65阳性表达主要在细胞核内，VIDAS 21计算机图像分析系统测定一定面积阳性信号值和阳性信号平均吸光度，并计算二者乘积，即积分吸光度。测定时每一病理切片在高倍镜下随机取10个视野，取其平均值。
1.7 统计学分析
数据以±s表示，用SPSS 11.5进行方差分析，变量间相关性检验采用直线相关分析。
2 结 果
2.1 各组三酰甘油和胆固醇水平比较
高脂组、卡维地洛组血清三酰甘油及胆固醇水平均明显高于正常对照组（F=146.25、287.83,q=14.76～20.75,P<0.01），而两组之间差别无统计学意义（q=0.53、0.59,P>0.05）。见表1。
2.2 各组血清SOD活性和MDA含量比较
高脂组SOD活性较正常组明显降低，MDA明显增加，而卡维地洛组SOD较高脂组则有所升高，MDA有所降低，差别有高度统计学意义（F=21.65、75.64,q=4.98～24.29,P<0.01）。见表2。
2.3 免疫组化检测结果
PCNA和NFκBp65阳性染色定位于细胞核，染成棕褐色，正常组阳性着色很少见。高脂组PCNA和NFκBp65阳性染色主要分布在内膜及中膜靠近内膜处，较正常组和卡维地洛组明显增多，差别有高度统计学意义（F=426.12、521.38,q=56.15～75.87,P<0.01）。见表3。相关分析结果，PCNA与NFκBp65呈正相关（r=0.975，P<0.01）。表1 各组家兔血脂水平比较表2 各组家兔血清SOD及MDA水平比较表3 各组家兔主动脉血管壁PCNA及NFκBp65半定量结果比较