高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀的血药浓度

【摘要】目的 建立高效液相色谱—串联质谱法测定阿托伐他汀血药浓度的方法。方法 采用纯乙腈超声提取，高速离心沉淀蛋白后，以乙腈-乙酸铵缓冲液作为流动相，Phenomenex Luna 3μ C18(2) 100 A (150×2.00mm 3μm)反相色谱柱，在正离子模式下以电喷雾电离串联质谱进行测定。结果 血浆中阿托伐他汀的线性范围为0.1-20 ng/mL，定量限为 0.1 ng/mL。方法回收率为 96%～103%，日间 、日内RSD 均小于6%。 结论 本方法简单、灵敏、准确，适用于阿托伐他汀人体血药浓度的检测。 
【关键词】阿托伐他汀  血药浓度  高效液相色谱—串联质谱法（LC-MS/MS） 
        阿托伐他汀钙片是他汀类血脂调节药，为3-羟基-3-甲基一戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂[1]，它能够降低血浆胆固醇和脂蛋白水平，减少低密度脂蛋白的生成，临床上用于家族性高胆固醇血症、混合性高脂血症等症。因其降脂作用强，副作用小，在高脂血症，特别是高胆固醇血症的治疗中得到广泛应用[2]。本文建立了高效液相色谱—串联质谱法测定血浆样品中的阿托伐他汀，本法专灵敏度高、重现性好，样品处理方法简便。化学结构见图1。 
          
        图1 阿托伐他汀的结构式
        Fig.1 Structure of Atorvastatin
        1  实验部分
        1.1材料和试剂
        阿托伐他汀标准品购自中国药品生物制品检定所；前处理所用乙腈为分析纯，流动相的乙腈为色谱纯（德国 MERCK）；实验用水为超纯水，由 Milli-Q系统制作（美国Millipore公司）。
        1.2液相色谱条件
        液相色谱仪器为岛津Prominence UFLC；色谱柱选用Phenomenex Luna 3μ C18(2) 100 A (150×2.00mm  3μm)；柱温40℃；流动相：乙腈—乙酸铵缓冲液（乙酸铵5mmol／L、甲酸0.5％（v/v））（体积比6：4），等度洗脱；进样量10μL；流速保持在0.3mL/min。
        1.3质谱条件
        质谱仪器为美国AB公司的API4000 Q-trap；电离方式：ESI（+）；选择多重反应监（MRM）；电离电压5500V，辅助加热温度500℃，气帘气30psi，雾化气3psi，碰撞气：中等，离子源气体1：50psi，离子源气体2：60psi。阿托他汀在ESI（+）[M+H]+ 的MRM模式下的质谱参数见表1。
        1.4血浆样品处理
        精确量取血浆样品0.5mL于10mL离心管中，准确加入2.5mL乙腈，涡旋2min后，超声10min，在 4500r/min转速下离心5min。移取上清液用氮气吹干，用1mL的50%乙腈水定容 ，过0.22μm滤膜 ，供LC-MS-MS分析。
        表1 阿托伐他汀在ESI（+）[M+H]+ 的MRM模式下的质谱参数
        Table 1  Test parameters for Atorvastatin in MRM 
          
        ＊定量离子对(quantitative ion pair)
        2 结果与讨论
        2.1方法的线性范围、 相关性及检出限实验
        以在血浆空白样品基体中六点添加标准品法制作校正曲线, 7点添加水平分别是0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL。按本文方法进行加标回收试验，结果表明，方法此范围内线性相关，相关系数r=0.9998，当信噪比S/N≥10时，定量下限LOQ为0.1 ng/mL。
        2.2方法的精密度和回收率
        取空白血浆，分别精确加入适量的阿托伐他汀标准溶液，配制成浓度为0.2 ng/mL、2 ng/mL.10 ng/mL的血浆样品各6份，按1.4步骤处理在同日内重复测定5次，并连续5天测定，计算日内、日间的精密度。得到的日内精密度（RSD%）分别为2.62、3.11、1.97，日间精密度分别为3.55、5.65、4.98。阿托伐他汀0.2 ng/mL、2 ng/mL、10 ng/mL三个水平浓度的测定回收率结果见表2。