芪丹通脉片对急性缺血/再灌注大鼠心肌一氧化氮合酶系统的影响

               作者：李军昌,王 文,王宗仁,郑建勇,刘家云

【摘要】  目的 观察芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、缺血/再灌注模型组、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅰ组、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅱ组。大鼠麻醉开胸,结扎冠状动脉前降支40 mim,再灌注4 h。TUNEL法测定大鼠心肌组织的细胞凋亡,化学比色法检测心肌组织中总的一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,并计算出结构型一氧化氮合酶(cNOS)的活性。结果 不同剂量的芪丹通脉片预处理抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡,其凋亡指数与模型组比较均存在显著差异(P<0.05,P<0.01)。与假手术组比较,模型组心肌组织iNOS的活性增加(P<0.05),cNOS活性降低(P<0.01)。不同剂量的芪丹通脉片能够抑制心肌缺血/再灌注大鼠iNOS的活性(P<0.05),增加cNOS活性(P<0.05,P<0.01)。结论 芪丹通脉片能够抑制缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡可能与调节心肌组织中NOS的活性有关。

【关键词】  芪丹通脉片；缺血/再灌注损伤；心肌；一氧化氮合酶；大鼠

      缺血性心脏病本质的病理改变是缺血心肌细胞因缺氧而坏死或凋亡,尽早恢复血液灌流是治疗缺血性心脏病的首要措施。然而,再灌注损伤成为患者从缺血后复流获益的最大障碍。再灌注过程中,内源性一氧化氮(NO)所具有的双重性生物效应与NO的来源、释放的量以及靶组织的状态等多种调控环节相关。心肌中的一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是NO的限速酶,其同功酶的活性影响着NO的生物效应。芪丹通脉片能够减少急性心肌梗死面积,促进心脏功能恢复[1],并改变犬心肌和血清中NO的水平[2]。本观察其对急性缺血/再灌注心肌细胞凋亡和再灌注心肌NOS的影响。

　　1  实验材料

　　1.1  动物

    健康成年SD雄性大鼠30只,体重250～270 g,第四军医
大学动物中心提供,合格证号：200505。

　　1.2  药物和主要试剂
   
　　芪丹通脉片提取浸膏干粉(黄芪30 g,丹参30 g,当归15 g,红花30 g,桂枝10 g,2.862 g原药材/g干粉)由中国人民解放军第四军医大学科研药厂提供,以生理盐水配制成混悬液324 g/L。TUNEL试剂盒为Roche公司产品,NOS和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)测定试剂盒购自南京建成生物工程公司,BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司。

　　2  实验方法

　　2.1  分组及给药
   
　　将大鼠随机分为4组：假手术组(A组)、缺血/再灌注模型组(B组)、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅰ组(C组)、芪丹通脉片＋缺血/再灌注Ⅱ组(D组)。A、B组给予生理盐水[10 mL/(kg·d)]灌胃,C、D组分别给予芪丹通脉片浸膏混悬液1.08 g/kg和3.24 g/kg灌胃[10 mL/(kg·d)],均连续灌胃6 d。第7日,灌胃完成30 min后进行造模。

　　2.2  心肌缺血/再灌注大鼠模型的制备
   
　　参考文献[3]方法。雄性SD大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30 g/L(45 mg/kg)麻醉。经颈部正中切口,插入气管套管,行呼气末正压通气(空气通气量20 mL/kg,频率48～50次/min)。经右颈动脉插入左心导管以测心功能参数。标准导联Ⅱ记录心电图(RM6200多导生理记录仪,成都仪器设备厂)。在胸骨左侧约0.5 cm处从第4肋纵行切口开胸,剪开心包,暴露心脏,以左冠状动脉主干为标志,在左心耳根部下方2 mm处用无创小圆针穿过左冠状动脉左降支根部下方的心肌表层,穿5-0线,将缝合线穿过小硅胶管后备用；待心电图恢复稳定,10 min后记录正常参数。在硅胶管远端的收紧缝合线至硅胶管,形成弓状并固定,以阻断左前降支阻断血流造成缺血,以心电图ST段和(或)T波抬高或降低等心肌缺血波形为结扎成功指标,缺血40 min,松解并除去硅胶管和多余缝合线,恢复左冠状动脉前降支,实现再灌注,逐层缝合胸壁,恢复自主呼吸。A组动物开胸,冠状动脉下穿线,但不结扎。

　　2.3  TUNEL法测定心肌细胞凋亡
   
　　再灌注结束后迅速剪下心脏,置于冰的PBS中洗净残血；分离左心室前壁缺血边缘区,于4%多聚甲醛中固定12 h,石蜡包埋。检测前对石蜡切片进行微波修复,标记前用DNA酶处理切片做阳性对照。在染色过程中用PBS代替TdT反应液,其余同说明书操作,作为阴性对照。

　　2.4  心肌组织中一氧化氮合酶活性的测定

    实验完毕,摘除部分结扎线以下,置于冰的生理盐水中冲洗,除去血液,滤纸拭干,立即入液氮12 h后,转至-70 ℃存放。分析天平称取0.1 g左心室心肌组织,用生理盐水制备成10%的组织匀浆,倒入离心管中,3 000 r/min离心10 min,取上清液,用NOS测定试剂盒(化学比色法)测定大鼠心肌组织中总NOS活性和iNOS活性,NOS与iNOS之差为结构型一氧化氮合酶(constrictive nitric oxide synthase,cNOS)的活性。BCA蛋白定量试剂盒(Pierce,UK)进行蛋白定量。

　　2.5  统计学方法

　　数据均以x±s表示,应用SPSS10.0软件进行数据统计。同组前后使用配对t检验,组间比较应用方差分析。

　　3  结果

　　3.1  芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤大鼠心肌一氧化氮合酶的影响

　　(见表1)表1  芪丹通脉片对缺血/再灌注损伤大鼠心肌NOS的影响(略)注：共30只大鼠,其中24只完成实验,有6只因未完成全部实验过程被排除；与A组比较,#P<0.05,##P<0.01；与B组比较,*P<0.05,**P<0.01

　　3.2  芪丹通脉片对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响

    TUNEL染色结果显示,凋亡心肌细胞胞体缩小,染色不均,细胞核被明显染成棕红色。B组心肌细胞凋亡指数为(21.3±4.2)%,芪丹通脉片(1.08 g/kg,3.24 g/kg)作用后分别为(14.3±3.8)%和(10.6±2.0)%,与B组比较,芪丹通脉片能够减少心肌细胞的凋亡指数,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。