加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型表达的影响

                 作者：傅擎宇,黄娟,陈泽奇,熊丽丽

【摘要】  目的 观察加味补肝汤对糖尿病大鼠坐骨神经中蛋白激酶Cβ亚型(PKC-βⅡ)mRNA表达的影响,探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。方法 65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,以链脲佐菌素诱发糖尿病模型,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组、加味补肝汤组。分别于治疗后4、8周处死大鼠,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定坐骨神经中PKC-βⅡ mRNA的表达。结果 治疗后4、8周模型组大鼠PKC-βⅡ mRNA表达明显高于正常对照组(P＜0.05),加味补肝汤组PKC-βⅡ mRNA表达明显低于同期模型组(P＜0.05)。结论 加味补肝汤对实验性糖尿病大鼠周围神经病变有一定的防治作用。

【关键词】  加味补肝汤；糖尿病；坐骨神经；蛋白激酶Cβ亚型；大鼠

    Abstract：Objective To observe the effect of Jiawei Bugan decoction on PKC-βⅡ expression of sciatic nerve in experimental diabetic rat and explore its preventive and therapeutic effects on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats. Methods In 65 rats involved, 45 rats were made as model and 20 were used as control. The diabetic rat model was established by streptozotocin (STZ). Forty model rats were randomly divided into model group and Jiawei Bugan decoction group. The rats were killed on 4th or 8th week from the beginning of treatment respectively, and PKC-βⅡ mRNA of sciatic nerve was detected by reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Results PKC-βⅡ expression of the model group on 4th or 8th week was higher than that of the normal control group (P＜0.05), while that of Jiawei Bugan decoction group were markedly lower than the model group (P＜0.05). Conclusion Jiawei Bugan decoction has preventive and therapeutic effect on peripheral neuropathy in experimental diabetic rats.
   
　　Key words：Jiawei Bugan decoction；diabetes；sciatic nerve；protein kinase c-βⅡ；rat
 
    糖尿病周围神经病变(DNP)是目前糖尿病患者致残的主要原因。大量研究表明,蛋白激酶C信号传导通路与糖尿病微血管并发症发生相关,尤其与蛋白激酶Cβ亚型(PKC-βⅡ)关系更为密切[1]。目前已阐明,该通路在糖尿病视网膜病变及肾病发展中起重要作用[2],但糖尿病神经组织中的情况仍存在争议。为此,笔者观察了PKC-βⅡ在实验性糖尿病大鼠2个月坐骨神经的表达变化情况及中药汤剂加味补肝汤对其的影响,探讨其对实验性糖尿病大鼠周围神经病变的防治作用。

　　1  实验材料

　　1.1  动物

    8周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠65只,体重250～280 g,上海斯莱克实验动物有限责任公司提供,许可证号SCXK(沪) 2003-003。

　　1.2  药物

    加味补肝汤(枸杞子15 g,木瓜15 g,当归10 g,川芎10 g,熟地黄12 g,白芍15 g,桑寄生15 g,麦冬15 g,花粉15 g),中药饮片由中南大学湘雅医院药剂科提供。中药饮片加水300 mL,浸泡30 min,水煎40 min,第2次煎时加水200 mL,煎煮20 min,取煎汁,混匀,水浴浓缩成每1 mL含2.72 g原药材的药液。

　　1.3  仪器

    TC-512型PCR仪(英国TECHNE公司)；血糖仪(德国罗氏公司ACCU-CHEK)；Motic2000图像分析仪；MS302多媒体生物信号记录分析系统(广州中医药大学)。

　　1.4  试剂

    琼脂糖(北京鼎国公司)；溴化乙锭、链脲佐菌素(美国Sigma公司)；Trizol(MRC公司)；反转录(RT)试剂盒(美国MRI公司)；Pre Mix Taq(宝生物大连有限公司)；引物由上海生工生物技术有限公司合成；其他常规试剂由湘雅医院药剂科提供。

　　2  实验方法

　　2.1  分组

    65只大鼠适应性喂养1周后,随机取20只为正常组,45只造模,将造模成功后的40只大鼠随机分为模型组20只,加味补肝汤实验组20只。2组血糖值比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

　　2.2  造模及给药

    参照文献[3]方法。造模前禁食12 h,一次性腹腔注射1%链脲佐菌素(50 mg/kg,0.1 mol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液配制而成,pH4.2～4.5)诱发糖尿病,72 h后用血糖仪测定尾尖血血糖,凡血糖＞16.7 mmol/L为造模成功,造模不成功的大鼠按上述方法重复1次。正常组20只大鼠禁食12 h后一次性腹腔注射相等容积0.1 mol/L的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。

　　2.3  血糖测定

    尾静脉取血,采用葡萄糖氧化酶法,罗氏公司ACCU-CHEK血糖仪及试纸条测定。

　　2.4  神经电生理检测

    参照文献[4]方法并略加改进,分别于治疗后4、8周末进行神经电生理检测。大鼠一次性腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg),麻醉后俯卧固定,刺激电极置于坐骨切迹(刺激强度2.0 mV,刺激波宽3.0 ms),在踝部(远端)和右足二趾间分别插入记录电极,参考电极置于记录电极和刺激电极之间,并连接计算机MS302多媒体生物信号记录分析系统,记录远近端坐骨神经产生动作电位的潜伏期,测定两记录电极间的距离,神经传导速度为记录电极之间的距离/动作电位潜伏期之差。测定时保持被检测肢体温度在37 ℃左右。