乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素经皮渗透及协同促渗研究

　　2.5.3  试验步骤 

　　将皮肤室温解冻10 h后,平整置于扩散池的接合部,表皮层面向供给池,真皮层面向接收池,然后将两水平相对的扩散池夹紧密封,扩散面积为0.627 cm2。用移液管向接收池内加入5.0 mL PBS,向供给池内加入5.0 mL供给液,维持整个系统在(37±0.5)℃。搅拌子转速为700 r/min,分别在1、3、6、9、12、24 h从接收池内取0.2 mL,并补充同体积PBS。样品用HPLC法测定其浓度,通过下式计算累积透过药量。

　　Q＝(Cn×V＋∑Cn－1×0.2)A

    Q：单位面积累积透过药量(μg/cm2)；V：接收液体积(mL)；A：扩散池口面积(cm2)；Cn：第n次取样的浓度(μg/mL)；式中0.2为每次取样体积。以药物稳定透过皮肤时的累积透过药量Q对时间t进行线性回归所拟合直线的斜率即为经皮稳态渗透速率(   )V[μg/(cm2·h)]和(   )W[μg/(cm2·h)]；该直线与时间轴的交点为时滞(h)。根据公式(2.2)计算出试验药物在活性表皮和全皮中的扩散系DV和DW,以及角质层的扩散系数DS。
 
     式中：D代表扩散系数；Cs代表药物在皮肤表面的浓度；h和H分别是角质层和活性皮肤的厚度·；v和w分别代表活性表皮和全皮,s代表角质层。

　　3  结果

　　3.1  有效成分的稳定性

　　3.1.1  乌头碱稳定性 

　　乌头碱水溶液(A溶液,pH＝7.2)中,随着时间的延长乌头碱的含量逐渐减少,乌头碱主要分解成为另外2种产物,其中之一是经过炮制后的主要成分苯甲酰基乌头原碱。乌头碱酸性缓冲盐溶液(B溶液,pH＝5.0)中,48 h内乌头碱的浓度未变,未见有其他成分出现。乌头碱碱性溶液(C溶液,pH＝9.4)的成分变化与A溶液相似,并且分解程度更为显著,结果见表1。

    从表1看出,A溶液中10 min时还未见有分解产物生成,而C溶液在10 min时乌头碱已有35%分解。因此,pH对乌头碱的稳定性有很大影响,乌头碱在酸性条件下可以保持稳定长达48 h,在碱性条件下立即分解。因此,选择体外透皮试验的接收液需要考虑乌头碱在不同溶液环境中的稳定性。表1  溶液pH对乌头碱稳定性的影响(略)

　　3.1.2  延胡索乙素与人参皂苷Rg1稳定性 

　　延胡索乙素与人参皂苷Rg1在24 h内,于水溶液(pH＝7.2)与磷酸盐缓冲液PBS(pH＝5.0)中稳定,含量未发生变化,没有分解产物生成。

　　3.2  油水分配系数测定

    ３种有效成分的LogP由大到小顺序为：延胡索乙素(1.66)＞乌头碱(0.66)＞人参皂苷Rg1(0.57)。

　　3.3  有效成分透皮试验

　　3种有效成分在去角质层皮肤中的经皮渗透明显高于全皮,延胡索乙素对活性表皮的24 h累积透过量、稳态速率分别是全皮的2.7倍和2.4倍；乌头碱活性表皮的24 h累计透过量、稳态速率分别是全皮的2.7、1.3倍；人参皂苷Rg1活性表皮的24 h累计透过量、稳态速率分别是全皮的45、23倍。结果见表2。表2  延胡索乙素、乌头碱和人参皂苷Rg1的24 h累积透过量与经皮动力学参数(略)注：QW：24 h全皮累积透过量；QV：24 h活性表皮累积透过量；DW：全皮扩散系数；DV：活性表皮扩散系数；DS：角质层扩散系数；tdw：全皮时滞(下同)
 
　　3.4  有效成分组合透皮试验

　　3.4.1  延胡索乙素在不同组合中体外透皮试验 

　　延胡索乙素分别与人参皂苷Rg1、乌头碱合用,对改善延胡索乙素的经皮吸收作用不明显,反而显示了一定的抑制作用,但3种有效成分合用却可提高延胡索乙素的经皮吸收,使延胡索乙素24 h全皮累积透过量增加了64.0%,结果见表3。表3  延胡索乙素在不同组合中的24 h全皮累积透过量(略)

　　3.4.2  乌头碱在不同组合中体外透皮试验 

　　人参皂苷Rg1可以显著促进乌头碱24 h全皮累积透过量,提高量达87.3%,但延胡索乙素对乌头碱经皮渗透没有作用,3种有效成分合用,可显著增加乌头碱的经皮吸收,使其24 h全皮累积透过量增加了2.93倍。结果见表4。表4  乌头碱在不同组合中的24 h全皮累积透过量(略)

　　3.4.3  人参皂苷Rg1在不同组合中体外透皮试验 

　　乌头碱可以显著促进人参皂苷Rg1的24 h全皮累积透过量,提高量达109.2%,乌头碱与三七皂苷具有明显的相互协同促进作用。其中再加入延胡索乙素则没有明显的促进作用,三者合用使乌头碱24 h全皮累积透过量比单独使用增加了1.07倍。结果见表5。表5  人参皂苷Rg1在不同组合中的24 h全皮累积透过量(略)

　　4  讨论

    乌头碱在中性及碱性条件下均不稳定,有分解产物的生成,因此,如果选用中性溶液作为接收液就会影响乌头碱透皮结果的检测。乌头碱在酸性条件下稳定,24 h内不发生水解反应,因此,选用磷酸盐缓冲溶液(pH＝5.0)作为接收液。除了有效成分稳定性之外,溶解度也影响着接收液的选择。人参皂苷Rg1在水中溶解度很好。乌头碱与延胡索乙素在中性水溶液环境中溶解度很小,在酸性环境下溶解度有明显提高,可以使经皮渗透试验达到漏槽条件。

    对于亲脂性药物延胡索乙素与乌头碱,其活性表皮的扩散系数比角质层的扩散系数大得多。乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素对活性表皮的扩散系数分别为539.00、93.60、354.70(×10-10 cm2/s),分别是它们在角质层的扩散系数的123、25、149倍。这是因为角质层主要由角质细胞组成,细胞间隙含有甾醇、脂肪酸、各种脂质等成分,角质层整体为疏水性,而活性表皮为水性组织,密度和导电性仅比纯水略大,分子在其中的扩散性良好。通过比较发现,乌头碱对活性表皮及角质层的扩散系数相差倍数最小,角质层对乌头碱的阻碍作用相对较小,而对延胡索乙素与人参皂苷Rg1的阻碍作用较为明显。影响扩散系数的因素除了药物的亲水/亲脂性外,还有分子量大小、热力学活度等因素。延胡索乙素分子量最小,其在活性表皮及角质层的扩散系数均为三者中最大,同时人参皂苷Rg1分子量大于乌头碱,但其在活性表皮的扩散系数比较高,这可能与人参皂苷Rg1在活性表皮内优良的水溶性有关。
   
　　乌头碱与人参皂苷Rg1有显著的互相促进渗透作用(见表4、表5),人参皂苷Rg1使乌头碱24 h全皮累积透过量提高了87.3%,乌头碱也促进人参皂苷Rg1的经皮吸收。皂苷类成分是一种天然的非离子型表面活性剂,因此具备表面活性和增溶作用[5]。在人参皂苷Rg1与乌头碱体系中,人参皂苷Rg1对乌头碱有较为明显的促渗作用,可能是人参皂苷Rg1发挥了其表面活性剂中增溶的作用,使乌头碱在水环境及皮肤中的浓度均比乌头碱单用时有所提高,增加了乌头碱在介质中的有效浓度,改善基质与角质层之间的分配,从而提高了乌头碱的累积透过量。乌头碱对人参皂苷Rg1的促进作用,推测可能是因为双酯型乌头碱在角质层中蓄积(tdw＞8 h),与角质层脂质双分子层中的脂类发生作用,增加了角质细胞间脂质双重层流动性,使人参皂苷Rg1的渗透性有所提高。表面活性剂对药物的增溶作用与药物分子结构和分子极性有关,对药物增溶作用不同[6-7]。人参皂苷Rg1对乌头碱的促进作用较为明显,但对延胡索乙素并没有发挥出明显的促渗作用,可能与人参皂苷Rg1与乌头碱的极性相似(LogP相近),而与延胡索乙素极性不同(LogP相差较大),导致人参皂苷Rg1对延胡索乙素的增溶作用相对较弱有关。

    延胡索乙素经皮渗透的时间延迟(tdw＝3.6 h)明显低于乌头碱,没有在角质层产生蓄积,对角质层结构影响也比较小,因此对其他药物经皮促渗作用不明显。乌头碱与延胡索乙素之间的结果显示,延胡索乙素降低了乌头碱的透过量,这可能因为小分子量的延胡索乙素更易于扩散,影响了乌头碱的经皮渗透。

    三者合用结果显示,3种有效成分的24 h全皮累积透过量均有提高。延胡索乙素与任意单一成分组合时都没有出现被促进的现象,但在三者共存的情况下累积透过量提高了64%,推测可能是因为人参皂苷Rg1与乌头碱的联合作用的结果,具体机理还有待进一步研究。

    本实验通过对乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素不同配对组合经皮渗透研究,初步阐明了3种中药有效成分在经皮渗透中存在相互影响,在3种有效成分共存的体系中,三者的累积透过量出现64%～293%不同程度的提高；3种有效成分合用对经皮吸收会产生协同促进作用,其中乌头碱与人参皂苷Rg1之间的经皮协同促渗作用最为明显。这从药物经皮渗透动力学角度诠释了传统外用中药配伍的合理性,也将为现代经皮给药技术在传统外用中药制剂中的应用研究提供借鉴和帮助。

【参考文献】
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　　[2] 孙素兰,黄东峰,俞励平,等.巴布剂冰辛贴镇痛效果的实验[J].中国临床康复,2006,10(19)：59－62.

　　[3] 王 红,韦云川,韦继雯.中药透皮促进剂的研究进展[J].云南中医中药, 2008,29(11)：64－65.

　　[4] 曹韧南,朱春燕.中药透皮吸收促渗方法的研究进展[J].中国中药杂志, 2007,32(1)：18－20.

　　[5] 梁志齐,宗惠娟,李金华.功能性表面活性剂[M].北京： 中国轻工业出版社,2002.325－350.

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