乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素经皮渗透及协同促渗研究

来源:岁月联盟 作者: 时间:2015-06-05

                作者:张晴,孙玉明,汪 晴,郝佳佳,李子敬,李明慧  

【摘要】  目的 研究乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素的透皮吸收及其相互间经皮渗透的影响。方法 采用Permcell KH-5P型横式扩散池分别进行全皮和去角质层皮肤的体外透皮实验,用高效液相色谱法测定乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素的累积透过量,并计算出它们的经皮渗透动力学参数。测定有效成分的油水分配系数(LogP),考察2种及3种有效成分组合的透皮行为及相互影响。结果 乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素在全皮中的扩散系数分别为123.95、50.32、96.25(×10-10 cm2/s),在活性表皮中的扩散系数分别为539.00、93.60、354.70(×10-10 cm2/s),LogP依次分别为1.66、0.66、0.57。在3种有效成分共存的体系中,三者的累积透过量出现64%~293%不同程度的提高。结论 3种有效成分合用对经皮吸收会产生协同促进作用,其中乌头碱与人参皂苷Rg1间的经皮协同促渗作用最明显。

【关键词】  乌头碱;人参皂苷Rg1;延胡索乙素;油水分配系数;经皮渗透

    Abstract:Objective To study percutaneous absorption kinetics and synergistic penetration enhancement of tetrahydropalmatine, aconitine and ginsenoside Rg1. Methods The in vitro intact and stripped skin permeation experiments were carried out by using Permcell KH-5P horizontal proliferation system. The percutaneous kinetic parameters of tetrahydropalmatine, aconitine and ginsenoside Rg1 were determined by HPLC, and the transdermal behaviors of the three active ingredients and interactions of combination were investigated. Result The cumulative amounts in 24 h of intact skin of tetrahydropalmatine, aconitine and ginsenoside Rg1 were 123.95, 50.32, 96.25 (×10-10 cm2/s). The cumulative amounts in 24 h of stripped skin of them were 539.00, 93.60, 354.70 (×10-10 cm2/s). The LogP were 1.66, 0.66 and 0.57 respectively. Each component had cumulated amount permeated of improvement by 64%~293% in coexistence system of three active ingredients. Conclusion The combination of three active ingredients results in a synergistic enhancement effect on percutaneous absorption of every active ingredient, and it is shown that the maximal enhancement effect appears between aconitine and ginsenoside Rg1.

    Key words:aconitine;ginsenoside Rg1;tetrahydropalmatine;LogP;transdermal permeation
 
    川乌祛寒湿风痹、血痹,三七和营止血、通脉行瘀,行瘀血而敛新血,是活血止痛外用方剂中常用的两种药材,它们经常配伍使用,以达活血散瘀、理气止痛之协同功效,如云南白药中含有川乌和三七等药材,其活血止血、消肿止痛的功效显著[1]。延胡索活血、利气、止痛,也是止痛方剂中常用的中药材,如冰辛巴布剂由延胡索、三七等多种药材组成,对热刺激引起的疼痛抑制作用明显[2]。

    与口服给药不同,中药外治首先有效成分必须能够渗透进入体内,目前对中药经皮促渗的研究多集中在冰片、薄荷等挥发性成分的促渗上[3-4],而对经皮渗透和吸收的相互影响研究不多。本研究采用川乌、三七和延胡索中主要有效成分——乌头碱、人参皂苷Rg1与延胡索乙素,通过体外透皮试验,研究3种有效成分经全皮和去角质层皮肤的渗透动力学特征,考察不同组合对经皮吸收的影响,从现代经皮渗透动力学角度探讨并诠释传统外用中药配伍的合理性。

  1  材料

  1.1  仪器

    Permcell KH-5P型横式扩散池(日本Vidrex);LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津);J0100-3电子天平(沈阳龙腾电子有限公司);SYC15超级恒温水浴(巩义英裕予华仪器厂);pH计(PBH-3,上海三信仪表厂);LG16-W离心机(北京医用离心机厂)。

  1.2  药物与试剂

    乌头碱、延胡索乙素(西安山川生物科技有限公司,纯度大于95%);人参皂苷Rg1(南京青泽医药科技开发有限公司,纯度大于95%)。磷酸,三乙胺,磷酸二氢钾,磷酸氢二钾;甲醇、乙腈均为色谱纯。

  1.3  动物

    昆明种小鼠,雌雄兼用,鼠龄(50±2)d,体重(20±2)g,大连医科大学动物中心。

  2  方法

  2.1  分析方法的建立

  2.1.1  色谱条件

  2.1.1.1  乌头碱与延胡索乙素 

  色谱柱:Hypersil C18(150 mm×4.6 mm,5 mm),流动相:A相为0.25%磷酸水溶液,用0.05%三乙胺调pH至3.0,B相为甲醇。梯度洗脱系统B相:0~13 min 30%~34%,13~16 min 34%~55%,16~23 min 55%,23~25 min 55%~30%,保持30%至26 min。检测波长240 nm,流速1.0 mL/min,柱温30 ℃;进样量20 μL。延胡索乙素保留时间10 min,乌头碱保留时间22.5 min。

  2.1.1.2  人参皂苷Rg1 

  色谱柱:Hypersil C18(250 mm×4.6 mm, 5 mm),流动相体积比:乙腈-水=23∶77。流速1 mL/min,柱温30 ℃,进样量20 μL,检测波长:203 nm。人参皂苷Rg1保留时间11.6 min。

  2.1.2  线性关系 

  乌头碱浓度(C)在0.5~50.0 g/mL范围内与峰面积(A)线性关系良好,线性方程为A=8 095.6C+666.7, r2=0.999 5。延胡索乙素浓度(C)在0.5~50.0 g/mL范围内与峰面积(A)线性关系良好,线性方程为A=11 419C+1 889, r2=0.999 5。人参皂苷Rg1浓度(C)在0.92~92 g/mL范围内与峰面积(A)线性关系良好,线性方程为A=2 126.3C+502.9, r2=0.999 9。

  2.1.3  精密度 

  乌头碱:精密度日内RSD<0.9%(n=3),日间RSD<1.2%。延胡索乙素:精密度日内RSD<0.9%,日间RSD<1.1%。人参皂苷Rg1:精密度日内RSD<1.0%,日间RSD<1.5%。

  2.1.4  回收率测定 

  乌头碱平均回收率为100.6%,RSD=0.85%。延胡索乙素平均回收率为100.3%,RSD=0.86%。人参皂苷Rg1平均回收率为101.2%,RSD=0.98%。

  2.2  有效成分稳定性考察

  2.2.1  乌头碱稳定性
 
  将一定量的乌头碱用微量甲醇溶解,分别加入纯净水、按2005年版《中华人民共和国药典》(一部)附录方法配制PBS(pH=5.0)与0.05 mol/L的NaOH溶液,制得乌头碱水溶液(pH=7.2)、乌头碱酸性缓冲盐溶液(pH=5,配制方法见“2.5.2”项)与乌头碱碱性溶液(pH=9.4)。将3种溶液放入恒温水浴锅中[(37±0.5)℃],在配制后10 min及12、24、48 h取样,检测溶液内成分变化,实验结果采用高效液相色谱(HPLC)分析。

  2.2.2  延胡索乙素与人参皂苷Rg1稳定性 

  将延胡索乙素与人参皂苷Rg1分别加入一定浓度的磷酸盐缓冲液PBS(pH=5.0)和纯净水溶液(pH=7.2),放入恒温水浴锅中,维持温度为(37±0.5)℃,在配制后1、3、6、9、12、24 h取样,用高效液相色谱分析,考察其在酸性与中性条件下的稳定性。

  2.3  油水分配系数的测定

    分别测定3种有效成分的油水分配系数(LogP),以正辛醇-水为分配体系。将溶有一定量药物的水相装入试管,加入等体积的正辛醇,在一定强度下振荡,然后于2 000 r/min离心10 min,用HPLC法检测水相中药物浓度(CW)。设水相中原来的药物浓度为C,分配平衡后油相中的药物浓度为C-CW,LogP,用下式计算。
 
  2.4  离体皮肤的制备

    取昆明种小鼠,采用脱毛剂(含Na2S 7%)脱毛,48 h后断颈处死,取背部皮肤,确保角质层完好无损,除去皮下组织和脂肪,得到完整离体皮肤。将完整皮肤先用带表卡尺测量厚度,再用透明胶带完全粘附于皮肤表面后揭下,重复15~20次,得到活性表皮,也称去角质层皮肤。所得皮肤采用保鲜膜包裹好后置于密封袋,-20 ℃冰箱保存备用(1周之内使用)。

  2.5  体外透皮试验

  2.5.1  供给液的配制

  2.5.1.1  乌头碱与延胡索乙素供给液的配制 

  称量乌头碱与延胡索乙素原料药2 mg,分别加入40 mL纯净水,配制成乌头碱饱和溶液与延胡索乙素饱和溶液作为供给液。(37±0.5)℃下放置48 h,试验时取出备用。

  2.5.1.2  人参皂苷Rg1供给液的配制 

  称量人参皂苷Rg1原料药80 mg,加入40 mL纯净水,得到浓度为2 mg/mL的人参皂苷Rg1供给液。(37±0.5)℃下放置,实验时取出备用。

  2.5.1.3  含有2种有效成分供给液的配制
 
  3种有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同,配制方法同其单成分供给液的配制。故得到3种含有2种有效成分供给液,分别为人参皂苷Rg1-乌头碱、人参皂苷Rg1-延胡索乙素、延胡索乙素-乌头碱。

  2.5.1.4  含有3种有效成分供给液的配制 

  人参皂苷Rg1-延胡索乙素-乌头碱供给液,其各有效成分在供给液中的浓度与其单成分供给液的浓度相同,配制方法同其单成分供给液的配制。

  2.5.2  接收液的配制
 
  接收液为磷酸盐缓冲溶液(pH=5.0)。取磷酸二氢钾0.834 g与磷酸氢二钾0.087 g,加水使溶解成100 mL,用磷酸调节pH值到5.0。

图片内容