半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析

            作者：杨俊宝,朱秀志,罗成科,李俊,魏会廷,彭正松

【摘要】  目的 分析半夏种质资源在分子水平上的遗传多样性。方法 应用随机扩增多态性DNA技术(RAPD)对21份半夏种质资源进行检测。结果 29个引物共得到162条扩增DNA片段,其中123条(75.9%)的片段具多态性,揭示了半夏居群间较丰富的遗传多样性。利用UPGMA法进行聚类分析表明,所有材料可划分为3类,根据RAPD遗传相似系数划分的类群同地理分布有一定关系。结论 半夏种质资源在分子水平上确实存在较大遗传差异。RAPD标记可作为构建半夏DNA指纹图谱的有效工具。

【关键词】  半夏；随机扩增多态性DNA技术；遗传多样性；DNA指纹图谱

　　Abstract：Objective To discuss the genetic diversity of the germplasm resources of Pinellia ternata on molecular level. Methods  The genetic diversity of P. ternata 21 different populations were tested by RAPD markers. Results A total of 162 products were amplified by 29 10-mer arbitrary primers, 123 (75.9%) products were found to be polymorphic. The results revealed the abundant genetic diversity in P. ternata 21 different populations. The cluster analysis using UPGMA method showed that 21 populations were classified as 3 groups, and the genetic diversity in P. ternata based on RAPD GS was correlated with geographic distribution. Conclusion There actually existed much genetic diversity on molecular level among the germplasm resources of P. ternata. RAPD markers could be effective tools to construct DNA fingerprintings of P. ternata.
   
　　Key words：Pinellia ternata；RAPD；genetic diversity；DNA fingerprintings
 
　　半夏[Pinellia ternata (Thunb.) Breit.]是天南星科的多年生草本植物。其块茎入药,具有燥湿化痰、降逆止呕、清痞散结的功效[1],为我国的传统中药。由于受环境条件的影响和人们对其需求量的增加,半夏野生资源已近枯竭,同时对不同产地的半夏遗传背景、彼此间的遗传关系尚不清楚。因此,有必要运用分子生物学方面的新技术手段加强其种质资源遗传多样性研究,并开展半夏野生种质资源的保护工作,从而为进一步选育优良种质提供理论指导和依据。
   
　　随机扩增多态性DNA技术(random amplified polymorphism DNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参[2]、石斛[3]等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  药材

    采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。

　　1.2 DNA的提取

    取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3 g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入600 μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5 mL SDS抽提液[100 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；100 mmol/L EDTA(pH 8.0)；0.5 mol/L NaCl；1.5%(W/V) SDS]混匀。将1.2 mL匀浆转移至1.5 mL离心管,室温(>15 ℃)静置10 min。室温下12 000 r/min离心10 min,取上层水相于另一干净1.5 mL离心管,加入等体积氯仿-异戊醇(24∶1)进行抽提,重复抽提2～3次,直到界面清晰为止。取上清液加入到500 μL预冷(4 ℃)无水乙醇中沉淀DNA,此时可见絮状DNA沉淀下来。去上清液,沉淀经70%乙醇洗涤3次,空气中干燥后用TE溶解备用。用紫外分光光度计检测样品DNA浓度,通过计算,稀释到终浓度为50 ng/μL备用。

　　1.3  RAPD反应

    用Sangon公司生产的S系列的100个十聚体随机引物对材料进行扩增筛选,从中共筛选出谱带清晰的引物29个用于试验和统计分析,反应在BIO-RAD 的MyCyclerTM PCR仪上进行。反应总体积25 μL,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Taq酶,0.25 μmol/L引物；100 ng模板DNA,dNTPs各0.2 mmol/L。扩增前94 ℃预变性3 min,每循环在94 ℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72 ℃保温10 min,然后在4 ℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。

　　1.4 统计学方法

    RAPD扩增产物按条带有无分别赋值,有带记为1,无带记为0。利用软件POPGENE处理得到遗传相似系数(Genetic Similarities, GS)[4]。利用GS按不加权成对群算术平均法(unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA)进行聚类。统计分析在NTSYS pc[5]软件系统下进行。 表1  供试的半夏来源（略）