风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞的保护作用研究

　　3 结果

　　3.1 EJCT对H2O2损伤内皮细胞存活率的影响如图1所示，与正常组比较，模型组A490值极明显降低(P<0.01)。与模型组相比，EJCT 10，30 mg/L组的A490值分别明显和极明显高于模型组(P<0.05，P<0.01)。可见，EJCT 10，30 mg/L明显提高损伤的内皮细胞的存活率。

　　3.2 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞SOD活性的影响如图2所示，与正常组比较，H2O2损伤组内皮细胞SOD活性显著降低(P<0.01)。EJCT 3 mg/L组SOD活性显著升高(P<0.05)，EJCT 10，30 mg/L组SOD活性极显著升高(P<0.01)。表明EJCT能明显抑制H2O2所致细胞的脂质过氧化损伤，表现为细胞内SOD活性显著升高。与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，*P<0.05, ** P<0.01图1 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞存活率的影响(±s)与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，* P<0.05, ** P<0.01图2 EJCT对H2O2损伤的内皮细胞SOD活性的影响(±s)

　　3.3 EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响如图3所示，与正常组比较，模型组内皮细胞A490值极明显降低(P<0.01)。与模型组相比，EJCT 3 mg/L组的A490值明显高于模型组 (P<0.05)，EJCT 10，30 mg/L组的A490值极明显高于模型组 (P<0.01)。可见EJCT 3，10，30 mg/L明显提高高糖损伤的内皮细胞的存活率。

　　3.4 EJCT对高糖损伤的内皮细胞LDH的影响如图4所示，与正常组比较，高糖损伤组细胞培养液中LDH水平极显著升高(P<0.01)，EJCT 3，10，30 mg/L剂量组极显著降低高糖所致脐静脉内皮细胞LDH释放(P<0.01)。提示EJCT对高糖所致脐静脉内皮细胞损伤具有明显的保护作用。与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，* P<0.05, ** P<0.01图3 EJCT对高糖损伤的内皮细胞存活率的影响与正常组比较，## P<0.01;与模型组比较，**P<0.01图4 EJCT对高糖损伤的内皮细胞培养液中LDH的影响(±s)

　　3.5 EJCT对HUVEC细胞培养液中NO含量的影响如图5所示，与正常组相比，EJCT 3，10，30，100 mg/L均极明显增加HUVEC细胞培养液中NO含量 (P<0.01)，其增加百分率分别为8.8%，25.3%，45.9%和105.8%;硝普钠10 mg/L极明显增加HUVEC细胞培养液中NO含量 (P<0.01)，其增加百分率分别为114.3%。与正常组比较，*P<0.05, ** P<0.01图5 EJCT对HUVEC细胞培养液中NO含量的影响

　　4 讨论

　　MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。MTT能被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此能力，因此可以间接反映活细胞的数量[10]。用有机溶剂如DMSO溶解甲臜结晶，然后用酶标仪测定甲臜溶液光密度的A值。相关研究表明，在一定细胞数范围内，甲臜溶液的A值与活细胞数呈正比。从本实验MTT法结果中可以看出, H2O2 和高糖均使内皮细胞损伤，而EJCT具有抗 H2O2诱导和高糖诱导的内皮细胞损伤的作用。

　　H2O2能很容易地穿透细胞膜自由进入细胞，在细胞核内的H2O2可转变成具有高活性羟自由基，从而造成DNA链断裂，导致细胞损伤。H2O2可作为内皮细胞脂质过氧化反应的引发物。SOD是体内重要的抗氧化酶，能特异性地灭活并清除氧自由基，其活性高低可间接反映细胞或机体清除氧自由基的能力[11]。本研究显示H2O2损伤组细胞SOD活性显著降低， 而用EJCT预处理后，各剂量均可提高内皮细胞SOD活性，表明EJCT可能是通过抗过氧化损伤作用减轻H2O2所致的内皮细胞损伤。

　　血管内皮细胞出现损伤是糖尿病血管并发症发生的前提，高血糖可引起血管内皮细功能障碍和内皮细胞损伤。目前已有的观点认为，高血糖状态下产生了过多的氧自由基最终导致内皮细胞增殖受到抑制[12]。LDH是细胞损伤后的代谢产物，它的活力反映细胞损伤的程度。本实验中高糖(30 mmol/L)损伤组HUVECs A490值极明显降低，培养液中LDH含量明显升高。这表明高糖能引起内皮细胞氧化损伤，同时也抑制了细胞的增殖代偿能力。而用EJCT预处理后，各剂量均可提高内皮细胞A490值和降低培养液中LDH含量。表明EJCT可明显减轻高糖引起的HUVECs损伤，对血管内皮细胞损伤时的修复具有重要意义。

　　NO是由内皮细胞合成的血管活性物质，它能舒张血管平滑肌，抑制异常增殖和炎症反应，以及抑制血小板聚集等作用。可见，内皮源性NO对心血管系统的调控作用是广泛而又明确的，维持正常的NO水平，对心血管保护作用具有重要的意义。2型糖尿病患者常有血管内皮功能异常，已证实在血管内皮功能受损时内皮源性NO表达减少[1]。本实验中EJCT(3，10，30，100 mg/L)均明显增加HUVECs培养液中的NO含量，提示EJCT能促进NO的合成和释放，这也是其保护血管内皮的作用机制之一。

　　综上所述，风轮菜乙醇提取物(3，10，30 mg/L)能明显提高H2O2 诱导的和高糖诱导的内皮细胞存活率，使H2O2 损伤的内皮细胞内低下的SOD活力回升，降低高糖诱导的内皮细胞LDH释放。另外，EJCT(3，10，30，100 mg/L)均明显增加HUVEC培养液中的NO含量。可见，风轮菜乙醇提取物具有明显的保护血管内皮细胞作用，其作用机制可能与其抗氧化活性和促进NO的合成与释放有关。鉴于风轮菜乙醇提取物具有降血糖活性，故在防治糖尿病血管并发症方面具有良好的前景。

【参考文献】
  　　[1] 向光大. 血管内皮功能异常与2型糖尿病血管并发症[J]. 临床内科杂志，2007，24(12)：797.

　　[2] Karsten Sydow, Thomas Munzel. Diabetes mellitus, oxidative stress and endothelial dysfunction[J]. International Congress Series, 2003，1253：125.

　　[3] Boguslaw Lipinski. Pathophysiology of oxidative stress in diabetes mellitus[J]. Journal of Diabetes and Its Complication, 2002，15: 203.

　　[4] 迟海东，路金才. 风轮菜属药用植物研究进展[J]. 沈阳药科大学学报，2006, 23(2)：123.

　　[5] 田冬娜，吴斐华，马世超，等. 风轮菜乙醇提取物的降血糖作用及其机制研究[J]. 中国中药杂志，2008，33(11)：1313.

　　[6] E. A. Jaffe, R. L. Nachman, C. G. Becker, et al Culture of Human Endothelial cells Derived from umbilical veins [J]. J. Clin. Invest, 1973, 52: 2745.

　　[7] 许晶兰，王孝铭，王东霞. 复方丹参滴丸对过氧化氢损伤的人脐静脉血管内皮细胞的保护作用[J]. 中国病理生理杂志，2006，22(5)：929.

　　[8] 张 锦，李东野，万美蓉，等. 高糖抑制内皮细胞增殖的细胞周期调控[J]. 江苏医药，2007，33(3)：279.

　　[9] Yukichi Okuda, Kazuko Kawashima, Seiji Suzuki, et al Restoration of nitric oxide production by aldose reductase inhibitor in human endothelial cells cultured in high glucose medium[J]. Life sciences, 1997, 60(3): 53.

　　[10] Mosmann T. Rapid colorimetric assay for celluar growth and survival : application to proliferation and cytotoxicity assays [J]. J Immunol Methods, 1983, 65 (1-2): 55.

　　[11] 彭 亮，李知敏. 紫萍提取物对过氧化氢诱导内皮细胞氧化损伤的保护作用研究[J]. 时珍国医国药，2009，20(4)：996.

　　[12] Kwang Sik SUH, Yeon Ho NAM, Young Min AHN, et al Effect of Scutellariae Radix extract on the high glucose induced apoptosis in cultured vascular endothelial cells[J]. Biol. Pharm. Bull, 2003，26(11): 1631