通脉醒脑滴丸对线栓法致脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡线粒体信号转导通路的影响
【摘要】 目的 探讨中药复方制剂通脉醒脑滴丸防治脑缺血卒中可能的机理。 方法选用大鼠线栓阻断大脑中动脉法复制脑缺血再灌注模型，运用免疫组化方法，测定脑组织bcl-2、Bax、Cyt-C和Caspase-3的表达，考察药物对Caspase-3细胞凋亡通路的作用。结果通脉醒脑滴丸下调神经细胞的促凋亡基因Bax、Caspase-3和CytC表达。结论研究初步证实通脉醒脑滴丸对脑缺血损伤的保护作用，可能与负调Caspase-3介导的细胞凋亡通路有关。
【关键词】 通脉醒脑滴丸; 脑缺血; 再灌注
脑缺血卒中作为临床常见的危重急症，一直备受关注。目前认为对脑缺血的治疗核心在于对神经元损伤的保护以及溶栓再通。是否能在脑缺血卒中发生后，尽可能延缓细胞凋亡组织坏死的进程，减轻神经元的损伤，是考察药物对脑缺血保护作用的要点。
本实验选用大鼠线栓法致局灶性脑缺血再灌注模型，采用免疫组织化学方法检测脑组织神经细胞bcl-2、Bax、Cyt-C、Caspase-3的表达，探求药物是否可通过影响bcl-2或Bax的表达，影响Cyt-C在线粒体膜的聚集，进一步影响凋亡因子Caspase-3的表达，发挥其对抗缺血脑组织损伤和神经细胞凋亡的作用。
1 材料
1.1 药物受试药物：通脉醒脑滴丸，成都润华堂药业有限公司产品，批号：070530。规格：10 mg/粒。用法用量：口服，88粒/d，分4次服用。主治缺血性中风引起的半身不遂、口眼歪斜、言语不利、偏身麻木等。阳性对照药物：尼莫地平片，山西亚宝药业集团股份有限公司产品，批号：070109。规格：20 mg/片。用法用量：用于治疗缺血性脑血管病，口服，30～120mg/d。
1.2 试剂Rabbit Anti-Caspase-3，北京博奥生物技术有限公司产品;Cytochrome C(A-8)SC-13156，北京中杉金桥生物技术有限公司产品;Bax(P-19)SC-526，北京中杉金桥生物技术有限公司产品;bcl-2 GM88702，基因有限公司产品;ChemMate Envision HRP鼠/兔 GK500705，基因有限公司产品;其它实验室常备试剂均为国产分析纯。
1.3 仪器Leica rm 2135石蜡切片机，德国;Olympus-BX40型光学显微镜，日本Olympus公司产品;MIAS2000型计算机图像工作系统，电子科大金盘多媒体科技有限公司产品;LD2-5医用离心机，北京医用离心机厂产品;WH-2型微量旋涡混合仪，上海沪西分析仪器厂产品;DHW-600型不锈钢电热恒温水箱，北京国华医疗器械厂产品;202-2型干燥箱，上海市实验仪器总厂产品。其它实验室常备器皿、耗材均为国产优质品。
1.4 动物 SD大鼠，SPF级，质量(300±20)g，雌雄各半，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(川)2004-15。
2 方法
2.1 分组及给药选取健康SD大鼠18只，雌雄各半，随机将大鼠分为模型组、给药组、假手术组3组，每组6只。其中给药组给予通脉醒脑滴丸73.85 mg/kg;模型组和假手术组给予等体积蒸馏水。灌胃给药，1次/d，连续给药7 d。于第7天给药1 h后，假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予阻断血流。模型组和给药组参照下述方法，复制线栓法致大鼠脑缺血再灌注模型。
参照文献方法[1～3]，第7天给药1 h后，腹腔注射10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)将大鼠麻醉，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在距CCA分叉部4 mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，实现对大脑中动脉(MCA)的阻断。固定线栓。逐层缝合切口并消毒。MCA阻断2 h后，拔出线栓，进行再灌注。假手术组大鼠仅在麻醉状态下分离右侧颈总动脉，不予插入线栓阻断血流。
再灌注24 h后，各组大鼠10%水合氯醛3.5 ml/kg(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，剪开胸壁，暴露心脏，将灌流装置的针头刺入左心室，止血钳固定，剪开右心耳，生理盐水250 ml快速灌流冲洗至肺叶和肝脏变白，换用4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液250 ml灌注固定，30 min后断头取脑，置于4%多聚甲醛中低温避光固定24 h。心脏灌流前1h给药1次。
常规制备石蜡切片，HE染色项下，采用DAKO EnVision显色系统，光镜100×视野下寻找海马结构，400×视野下，运用电子科技大学金盘科技有限公司MIAS2000型计算机图像工作系统，对染色结果进行检测，每张片选取不重叠的10个视野，每个视野选20个细胞，统计阳性表达的细胞数和阳性面积百分比。
2.2 统计方法运用SPSS 13.0统计软件进行统计分析。
3 结果
3.1 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Bax表达的影响结果见表1。表1 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠 脑组织神经细胞Bax表达的影响(±s)
在高倍镜下，免疫组织化学染色结果显示：大鼠脑组织神经细胞Bax蛋白主要在胞浆出现阳性表达。正常大鼠神经细胞Bax有一定的阳性表达，而脑缺血再灌注大鼠的神经细胞表达则出现几乎满视野表达，染色呈棕黄或黄褐色。从表1可见，模型组大鼠脑组织神经细胞的Bax表达较假手术组有明显的升高(P<0.01)。通脉醒脑滴丸组较之模型组，Bax阳性细胞表达和阳性面积比明显降低(P<0.01)，提示通脉醒脑滴丸具有减少大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞Bax表达的作用。
3.2 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织细胞色素C(Cyt-c)表达的影响表2 对线栓法致脑缺血再灌注大鼠脑组织神经细胞Cyt-C表达的影响(±s)