肾康注射液与苯那普利对肾小球系膜基质作用的对比研究

　　内容提要　目的：探讨肾康注射液与苯那普利对人肾小球系膜细胞外基质(ECM)不同成分的抑制作用强度。方法：采用体外培养的人肾小球系膜细胞技术，观察具有降逆泄浊、益气活血功效的中药肾康注射液及苯那普利对ECM不同成分的影响。结果：肾康注射液具有抑制ECM成分中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)和Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)的作用，该抑制作用具有一定的量效关系。苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但不及肾康注射液作用明显。结论：肾康注射液对ECM的抑制作用优于苯那普利。

Contrast Study on Effect of Shenkang Injection and Benazepril on Human Glomerular Mesangial Extracellular Matrix

　　Objective: To explore the intensity of inhibition of Shenkang Injection (SKI) and Benazepril on various ingredients of human glomerular mesangial extracellular matrix (ECM).Methods: Effect of SKI, a herbal preparation for lowering adverse Qi, despelling turbidness, supplementing Qi and activating circulation, and Benazepril were observed by cultured glomerular mesangial cell technique in vitro.Results: SKI could inhibit the fibronetin, laminin, and type Ⅳ collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit the fibronetin and type Ⅳ collagen of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of SKI was superior to Benazepril in inhibiting ECM. Ⅳ collagen of ECM, and the action was dose-dependent. Benazepril could also inhibit&nb sp;the fibronetin and type Ⅳ collagen of ECM but was weaker in intensity.Conclusion: The effect of SKI was superior to Benazepril in inhibiting ECM.

　　Key words　Shenkang Injection, Benazepril, mesangial cell, extracellular matrix

　　肾小球疾病具有进行性加重的特征，而且各种类型的肾小球疾病的最终结果都表现为肾小球硬化的形成。肾小球硬化是多种原因引起肾小球损伤后出现的共同转归，是慢性肾功能衰竭(CRF)的主要病理基础。近年来，随着对肾小球硬化机制认识的不断深入，肾小球系膜细胞(MC)、细胞外基质(ECM)及各种细胞因子在肾功能进行性减退过程中所起的作用倍受关注。抑制MC增殖，减少ECM的堆积，拮抗细胞因子的不良作用，已成为防治肾小球硬化，延缓CRF病情进展的重要环节。本研究采用人肾小球MC体外培养技术，观察了具有降逆泄浊、益气活血功效的肾康注射液对ECM中纤维连接蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)及Ⅳ型胶原(Col Ⅳ)含量的影响，并以苯那普利作为阳性对照，冀从细胞水平探讨其延缓肾小球硬化的作用强度及作用机制。

　　材料与方法

　　1　材料

　　1.1　肾组织来源　系我校附属妇产科孕5月引产胎肾。

　　1.2　药物与试剂　肾康注射液(SKI)由大黄、丹参、红花等组成，成都中医药大学附属医院提供，每毫升含原生药0.3g；苯那普利(Benayzepril)由瑞士诺华制药有限公司生产，批号：012200；V型胶原酶、HEPES均系Sigma产品；RPMI 1640、胰蛋白酶、胰岛素均为美国GIBCO产品；小鼠抗人单克隆FN抗体、兔抗人FN多抗、羊抗兔IgG-HRP均购于北京中山生物技术有限公司；LN、Col Ⅳ放射免疫分析试剂盒，均购于上海海研医学生物技术中心。

　　1.3　主要仪器　CO2孵箱(TYPE4型)德国HERAEUS公司生产；倒置显微镜(TOKYO)日本OLYMPUS公司生产；洁净工作台(月坛牌)北京半导体设备一厂生产；酶标分析仪(MODEL2550)美国BTO-RAD公司生产；FT-613自动计数125 I放免测量仪，北京核仪器厂生产。

　　2　MC培养与鉴定　无菌取胎肾，分离提取肾皮质小球组织，按照于力方等方法(1)取去掉包囊的单个肾小球进行原代和继代培养，实验中使用传代5代的MC。培养的细胞经免疫病理鉴定证实为单纯的MC，无上皮细胞、肾小管细胞及成纤维细胞污染。

　　3　分组及MC上清的收集　吸取培养的第5代MC培养瓶中液体，加胰酶1ml，置孵箱(5% CO2、37℃)中消化3min，加10% FCS 1640终止液2ml，抽吸于离心管中，800rpm，离心3min，弃上清，加15% FCS 1640培养液于离心管中，吹打，混匀。用计数板计数后，倾入加样槽中，用8导加样枪，按每孔200μl，密度4000/孔铺板。将96孔板按列从左至右依次分为空白对照组(简称组Ⅰ)、苯那普利组(简称组Ⅱ)、肾康注射液高浓度组1、2(简称组Ⅲ、组Ⅳ)、肾康注射液中浓度组1、2(简称组Ⅴ、组Ⅵ)、肾康注射液低浓度组1、2(简称组Ⅶ、组Ⅷ)，共8组(列)，每列6孔，待细胞贴壁24h后，每孔加无血清1640培养液200μl同步24h。除空白对照组外，其余各组分别依次加入苯那普利10－3mmol/L及肾康注射液100、50、25、12.5、6.25、3.125μg/ml，待刺激48h后依次收集上清待测。

　　4　测定ECM中FN的含量　用双抗体夹心ELISA法，0.5mg/ml鼠 抗人FN抗体原液用包被缓冲液稀释1000倍。取96孔板，50μl/孔铺板，4℃过夜，甩去。用PBS－吐温20洗涤液洗板3次，每次3min，间隔2min，控干。每孔加1%BSA封闭液100μl，37℃，1h后甩去，控干。依次按组各孔分别加入待测上清50μl，37℃，3h后甩去，洗板4次后，加兔抗人FN抗血清(原液用0.1% BSA·PBS1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置60min。加HRP羊抗兔IgG(用0.1% BSA·PBS 1∶1000稀释)50μl/孔，室温放置50min。再洗板4次后，每孔加入OPD显色液50μl，预热酶标仪，用2M H2SO4终止液50μl/孔终止，立即在492nm波长读数，并记录OD值。

　　5　ECM中LN、Col Ⅳ含量的放射免疫法(RIA)测定　采用竞争法，将缓冲液稀释10倍，分别将125 I－LN、抗LN血清、125 I－ColⅣ、抗ColⅣ血清及二抗用缓冲液稀释，将待测上清分别与125 I－LN、125 I－ColⅣ及相应的抗血清混匀，4℃过夜反应，加二抗4℃反应60min，离心3500r/min 10min弃上清，125 I放射免疫测量仪计数。

　　6　统计学处理　数据均采用SDAS软件进行统计处理，结果用(±s)表示。

　　结　　果

　　肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响见表1。表1所示，在对ECM中FN含量影响方面，肾康注射液组(Ⅲ～Ⅶ组)与空白对照组(Ⅰ组)相比，均有显著性差异(P＜0.05～0.01)；说明肾康注射液除低浓度组2(Ⅷ组)外，其余各组对FN均有明显的抑制作用，而且随着浓度的递增此作用更加明显，并表现出一定的量效关系。实验还发现肾康注射液即使在极小浓度时对ECM中LN及Col Ⅳ的含量也有明显的抑制作用，该抑制作用也呈现出一定的量效关系。从表1还可看出，苯那普利组(Ⅱ组)在对FN、Col Ⅳ含量影响方面，与空白对照组相比也有显著性差异(P＜0.01～0.05)；但对LN影响方面，两者比较无显著性差异(P＞0.05)；说明苯那普利对ECM中FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但对LN其抑制作用不明显。另外，从表中还可看出，肾康注射液各浓度组(Ⅲ～Ⅷ组)与苯那普利组相比，在抑制LN方面也均有极显著性差异(P＜0.01)；除肾康注射液低浓度组2(Ⅷ组)外，其余各组与苯那普利组相比，在抑制Col Ⅳ方面也有显著性差异(P＜0.01～0.05)；肾康注射液高浓度组(Ⅲ组)与苯那普利组相比，在抑制FN方面也有显著性差异(P＜0.05)；说明肾康注射液在抑制ECM中FN、LN、Col Ⅳ含量方面优于苯那普利。

表1　肾康注射液与苯那普利对ECM成分含量的影响　(±s)

组别 n 药物 FN(OD值) LN(ng/ml) Col Ⅳ(μg/ml) 
Ⅰ 6 — 0.337±0.025 88.500±2.739 29.667±7.174 
Ⅱ 6 Benazepril 10－3mol/L 0.295±0.055* 83.667±6.088 17.000±3.521** 
Ⅲ 6 SKI 100μg/ml 0.252±0.030**△ 55.000±6.325**△△ 6.667±1.033**△△ 
Ⅳ 6 SKI 50μg/ml 0.264±0.028** 56.833±6.047**△△ 7.667±2.338**△△ 
Ⅴ 6 SKI 25μg/ml 0.271±0.031** 58.167±8.976**△△ 8.833±3.125**△△ 
Ⅵ 6 SKI 12.5μg/ ml 0.280±0.021* 62.667±5.086**△△ 9.333±3.933**△△ 
Ⅶ 6 SKI 6.25μg/ml 0.287±0.019* 72.000±3.688**△△ 10.500±3.886**△ 
Ⅷ 6 SKI 3.125μg/ml 0.333±0.012△ 74.667±1.966**△△ 14.333±4.083** 

　　注：与Ⅰ组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与Ⅱ组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

讨　　论

　　肾小球硬化时ECM的改变是近年来国内外肾脏病学者研究的热点之一，ECM在肾小球内的蓄积，是肾小球硬化的主要特征性变化(2)。无论是免疫性或是非免疫性(如糖尿病)损伤引起的肾小球硬化过程中，FN的变化早而明显，随后增多的是胶原，其中以Ⅳ、Ⅴ型为主(3，4)。因Col Ⅳ约占肾小球基底膜干重的50%，且有人推测LN与Col Ⅳ的合成是独自进行的再各自形成状结构，然后相互产生作用(5)，故目前对肾小球硬化时ECM改变的研究主要集中在FN、LN及Col Ⅳ的变化上。体外培养证实，肾小球的三种固有细胞(MC、上皮细胞、内皮细胞)均能产生ECM，其中以MC为最强(6)。肾小球MC属于肾脏血管周固有细胞，在正常情况下，MC的数量、形态和位置保持相对稳定，其合成基质的能力也较小(7)。但在肾炎时常发生异常活动，造成ECM的大量产生与积聚(4)。所以如何减少系膜基质的扩张，降低ECM在肾小球内的蓄积在防治肾小球硬化机制探讨中占有十分重要的地位。

　　苯那普利是第四代血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)。现已证实，肾脏具有独立的肾素－血管紧张素系统(RAS)，血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)是该系统最具有生物活性的因子。目前研究证实AngⅡ受体(ATR)至少有Ⅰ和Ⅱ两种亚型，其中Ⅰ型受体(ATR1)意义最大。该受体分布在肾小球MC上，与AngⅡ、AngⅢ有高度的亲和力(8)。进一步的研究还发现ATR1占肾内ATR亚型分布的90%以上，Osborne等在10余年前就报道动脉内注射3H标记的AngⅡ，发现3H-Ang Ⅱ只结合在肾小球系膜区，而不与肾血管、肾小管等部位结合。用125 I-AngⅡ进一步实验发现光镜下125 I-AngⅡ位于肾小球上，电镜下125 I-AngⅡ颗粒在MC浆中(9)。血管紧张素转化酶是RAS中最后一级酶促反应的关键酶，用ACEI能够抑制AngⅡ的形成，可使循环和组织中的AngⅡ水平下降，且可直接降低肾内AngⅡ的生成量，从而对抗AngⅡ对肾脏的不良反应，减轻肾小球硬化的发生。大量的研究还证实，ACEI除减轻肾小球的高灌注和高滤过作用外，还可通过阻断肾小球基底膜(GBM)上AngⅡ的特异作用的结合点，可使GBM固有的负电荷增多，并抑制GBM的进一步增厚，从而直接改善GBM的通透性(8)。目前体内外动物实验还证实，ACEI亦有抑制肾小球MC和系膜基质增生的作用，从而直接阻止肾小球硬化的形成(10)。近年来，临床上已成功地将ACEI用于各类肾脏病的，发现在降低蛋白尿，阻止肾小球硬化方面具有一定的作用。

　　本实验结果表明，肾康注射液对ECM中FN、LN、Col Ⅳ的含量具有明显的降低作用，并呈现出一定的量效关系。苯那普利虽对FN、Col Ⅳ也有一定的抑制作用，但此抑制作用远不及肾康注射液明显。从而提示MC是肾康注射液发挥治疗作用的重要靶细胞，减轻ECM的积聚可能是肾康注射液延缓肾小球硬化的重要作用机制之一。值得注意的是，苯那普利主要是通过抑制AngⅡ的形成，减轻其对肾脏的损害，从而在阻止肾小球硬化方面发挥着重要作用，而肾康注射液是否对AngⅡ的形成也有一定的抑制作用，值得进一步深入探讨。

　　1，于力方，陈香美，黎磊石.正常人肾小球系膜细胞培养的研究.中华肾脏病杂志1990；6(2)∶70—74.

　　2，孙喜元.肾小球损害机理进展.国外医学泌尿系统分册1994；14(5)∶196—199.&nbs p;

　　3，Nerlich A, Schleicher E. Immunohistochemical locolization of extracellural matrix components in human diabetic glomerular lesions. Am J Pathol1991；139(4)∶889—891.

　　4，Floege J, Johnson RJ, Gorder K, et al. I creased synthsis of extracellular matrix in mesangial proliferative nephritis. Kidney lnt1991；40(3)∶477—480.

　　5，Border WA. Extracellular matrix and glomerular disease. Seminars in Nephrology1989；9∶307—309.

　　6，张月娥.肾小球硬化发病机制研究进展.中华病杂志1994；23(1)∶4—6.

　　7，李月娟.体外培养的肾小球系膜细胞的形态、结构、间质合成功能及影响因素.国外医学泌尿系统分册1995；15(增刊)∶71—75.

　　8，Pfeilschifter J. Angiotensin Ⅱ　B-type　receptor mediates phosp-hoinositide hydrolysis in mesangial cells. Eur J Pharmacol1990；184(1)∶201—202.

　　9，Erdos EG, Skeldgel RA. Renal metabolism of Angiotensin Ⅰ and Ⅱ. Kidney lnt1990；supple30∶s24—s27.

　　10，Yoshida Y. Angiotensin converting eneyme inhibitor suppress accelerated growth of glomerular cells in vivo and invitro. Kidney Int1988；33∶296—298.