葡萄糖激酶基因启动子－30位点PCR扩增的实验条件研究

        2.1.3一般反应中每种dNTP的最终浓度可为20-200μmol/L。本项实验dNTP的浓度设计在20－200μmol/L
之间，共6个浓度，其他扩增条件不变的情况下设定系列dNTP浓度，范围设计在42-250μmol/L之间。结果表明：产物量随dNTP浓度的增加而增加，但在167μmol/L后产物量并无明显增多，选择其最适dNTP浓度为167μmol/L。
        2.1.4绝大多数PCR扩增方案中镁离子浓度在0.5 -10 mmol/L之间，但各反应有自己的最适酶离子浓度（差异较大）。其他扩增条件不变的情况下镁离子浓度在0.5-5 mmol/L之间设定6个梯度。结果表明：0.5mmol/L的Mg 2+浓度时扩增产物量很低，而1～2mmol/L的浓度产物量均较高，而2mmol/L后随着Mg 2+浓度的增加产物量有所降低，因此选择其中间值1.5mmol/L为实验中的最佳浓度。 
        3 讨论
        进行PCR扩增所涉及的实验条件很多，结合众多文献以及前期实验基础，并通过预实验，只对扩增时与产物的特异性及产量影响较大的Taq酶量、引物浓度、镁离子浓度以及dNTP浓度做了研究。
Taq酶浓度：本实验发现不同来源和不同批次的Taq酶因其活性有不同程度的变化，可导致扩增效率发生明显改变。扩增GCK基因启动子区长258bp的DNA片段效率较高，Taq酶的浓度对扩增体系的影响不大，30μl体系中0.5U的Taq酶就可以扩出目的DNA。而高浓度的Taq酶可以产生非特异性扩增。因此，同一研究中最好使用同一批次的Taq酶；在能检查到足够扩增产物的情况下尽量用低浓度的酶而增加扩增数量。
引物浓度：过低的引物浓度将导致扩增的失败，而过高的引物浓度又会对PCR的扩增起抑制作用，导致错配，产生非特异性产物，同时产生大量的引物二聚体，所以需要实验来确定最佳引物浓度。另外选择适当厂家合成的高质量引物且进行一定的纯化也是实验成功的关键[2]。
        dNTP的浓度：高浓度的dNTP会对反应起抑制作用，出现非特异性产物和错配现象，而浓度过低又会降低反应产物量。从理论上讲，dNTP的浓度应为：经50个PCR循环后dNTP的浓度是初浓度的50％左右。 
        Mg2+浓度：Mg 2+浓度是影响Taq酶活性的一个重要因素，此外还影响模板和PCR产物的解链。浓度过高，使反应特异性降低，浓度过低，又会降低Taq酶的活性，使反应产物的产量减少，而且只有游离的Mg 2+才对Taq酶有激活作用。所以依靠实验来确定最佳的Mg2+浓度是必要的。
        通过上述研究，不仅确定了PCR扩增GCK基因启动子区进而内切酶消化的各种最适实验条件，而且为进一步的大批样本研究奠定了基础，使实验结果更为准确、有效。
参 考 文 献
[1]段勇，王玉明，赵淮，等.从血细胞快速抽提DNA的方法探讨.昆明医学院学报，1998，19(2): 28.
[2]杨道理，王宝成. DNA扩增技术与医学应用. 山东科学技术出版社，1992：219.