抗乙型肝炎病毒耐药及防治策略

                     作者：朱复生 秦玉杰 张玲慧 

        核苷（酸）类似物是目前临床上治疗慢性乙型肝炎（慢乙型）的重要抗病毒药物。国内外已批准上市的核苷（酸）类似物分三类：（1）L-核苷类：如拉米夫定和替比夫定;(2)无环磷酸脂类：阿德福韦酯；（3）环戊烷/烯类：恩替卡韦。以上四种药物通过直接抑制HBV-DNA复制，改善肝脏组织学病变，延缓慢乙肝病情进展，疗效得到肯定[1]。但因该类药物对HBVCCCDNA无直接作用，需长期使用，易导致乙型肝炎病毒（HBV）产生耐药变异，如拉米夫定治疗一年耐药变异率为15-30%，第4-5年耐药变异率可高达65-75%[2]，阿德福韦酯治疗1-5年的耐药变异率分别为0，3%，11%，18%，29%[3]。临床医师应当合理制定抗病毒治疗方案，减少耐药变异的发生，同时监测病毒耐药变异情况，及时采取有效应对策略。
        1  HBV耐药机制及类型
        （1）HBV耐药相关性变异[4]:由于复制HBV水平高，明天可产生1012-13个病毒颗粒，在DNA负链合成的逆转录环节，HBV的逆转录酶缺乏纠错核对功能，一个复制周期中每105个核苷出现一个错配[5]，而HBV基因组只有约3200个碱基对，每天每个位点都可能产生任何形式的碱基改变，因此突变产生的速度相当快。治疗前就可能存在与耐药有关的变异株即原发性变异，治疗中在药物选择压力下，HBV又逐渐产生继发性变异。因核苷类药物作用靶点均为HBVDNA聚合物，在长期选择压力下该酶基因产生适应性变异，出现能继续复制的“逃逸株”，或使原发性变异株扩增成为优势株。变异株氨基酸序列改变，影响核苷类药物于HBVDNA聚合酶结合而产生耐药。
        （2）细胞机制[6]:核苷类似物首先要进入肝细胞内经过磷酸化才能发挥作用，不同个体的激酶活性及基质特异性可能参与耐药过程，此外细胞膜上的某些糖蛋白具有泵出核苷类似物的作用，是否参与耐药过程须进一步探讨。
        （3）HBV耐药类型：按发生顺序依次为：①基因型耐药，指HBV聚合酶基因组出现特定的核苷酸及相对应的氨基酸突变，且已被实验证实与病毒耐药有关。②病毒学耐药：指在基因型耐药基础上，出现HBVDNA反弹大于1log10，或由阴性转为阳性。③临床耐药：指在前两种耐药基础上出现ALT升高或肝脏组织学损伤加重[7]。从实验室角度还可将耐药类型分为表型耐药和交叉耐药。前者指在体外细胞培养实验药敏检测中，基因变异引起病毒株对药物的敏感性显著下降，抑制50%病毒所需有效浓度EC50增加若干倍;后者指由一种药物诱发的表型耐药，又引起对其它抗病毒药物的表型耐药。
        （4）病毒耐药的临床分类[8]:①初治无效（无应答）：核苷类药物治疗6个月后，血清HBVDNA较基线下降<1log10 IU/ml（1IU=5.6拷贝）。此时较高的HBVDNA水平与病毒耐药风险增加有关。②继发于耐药的治疗无效（病毒学反弹）：患者依从性良好情况下，连续2次间隔1个月以上血清HBVDNA从最低点升高≥1 log10 IU/ml。③生化学反弹：初始应答ALT正常后，继续治疗中ALT再次升高。某些病例可能肝炎病情加剧。
        2  耐药变异位点与交叉耐药
        目前常用核苷（酸）类似物耐药基因突变位点都位于HBVDNA逆转录酶区，主要是逆转录酶区的A，B，C，D区。拉米夫定是第一个应用于治疗慢乙肝的核苷（酸）类似物。对其耐药变异研究也最多。其变异位点主要在HBV聚合酶C区YMDD基因序列，最常见突变位点是M204氨基酸置换（rtM204I/V/S），或联合L180氨基酸置换（rtL180M）[9]。此外，还与rtv173L，rtL80V/I和rtA181T,rtI169T变异有关[10]。
        阿德福韦酯耐药变异位点集中于HBV聚合酶D区rt N 236 T,B区rt A 181V/T和rt I 223V[11]。
        恩替卡韦耐药位点是在拉米夫定耐药基础上另加rt T 184G，rt S 202G/I，rt M 250V等位点变异，因而恩替卡韦耐药需要三个位点氨基酸置换才能发生，拉米夫定治疗既能选择出拉米夫定耐药突变也可选择出恩替卡韦耐药突变[12,13]。
        替比夫定变异位点目前仅发现rt M 204I[9]。
        体外研究分析表明，HBV对核苷（酸）类似物存在交叉耐药现象。拉米夫定耐药病毒株（M204V+L180M）对恩替卡韦和替比夫定的敏感性下降，但仍然对阿德福韦酯敏感；阿德福韦酯耐药株（N236T）仍然对拉米夫定、恩替卡韦和替比夫定敏感，但阿德福韦酯耐药株（A181V）则对拉米夫定和恩替卡韦敏感性下降。这些研究结果可作为临床医师对耐药患者改变治疗方案的依据。
        3  应对耐药变异的策略
        （1）预防耐药——强效抗病毒治疗
        预防胜于治疗是医学基本原则。合理应用核苷类药物是预防耐药性的最有效措施。应严格按照《慢性乙型肝炎防治指南》[14]推荐的治疗指征和方案进行规范治疗，避免不必要的治疗和单药序贯治疗，减少药物筛选产生的耐药株。
        在抗HBV治疗中，初治药物的选择对预防耐药十分重要。Locarninis认为[14]，应选用强效抗病毒药物，快速持续抑制病毒载量至不可测水平，使发生耐药的机率降至最低;选用高耐药基因屏障的抗病毒药物，即需要多个位点同时变异才产生耐药的药物，减少耐药发生率，恩替卡韦符合上述条件[14]。Colono RJ等报告，恩替卡韦全球临床研究证实，对核苷初治患者恩替卡韦治疗4年，因耐药导致病毒学反弹累计发生率<1%,为目前上市核苷类药物中最低者[15];日本学者Masao Omata报告，日本核苷初治慢乙肝患者，连续三年监测耐药情况，恩替卡韦累计基因型耐药发生率为1.01%[16]。另外，联合治疗有可能减少耐药发生，如Sung等应用拉米夫定和阿德福韦联合治疗慢性乙肝初治患者，第一年耐药率由拉米夫定单独治疗时的20%降为2%[17]，提示联合治疗对减少拉米夫定耐药的作用，须进一步扩大临床观察。
        （2）预测耐药——优化治疗路线图，减少耐药
        贾继东等报告[18],替比夫定或拉米夫定在治疗24周时HBVDNA水平可预测52周时疗效，24周时HBVDNA水平越低，52周时疗效越好（包括PCR法检测HBVDNA阴性、ALT复常及HBeAg血清转换百分比），基因型耐药发生率越低。DiBisceglie A 等[19]同样以24周作为时间分界点，预测替比夫定治疗104周时疗效及耐药情况，24周时HBVDNA如低于PCR可检测水平（<300copies/ml，QL），则治疗至两年时HBeAg阳性者82%HBVDNA<QL，46%血清转换，83%ALT复常，4%发生病毒学耐药，而HBeAg阴性者HBVDNA<QL为88%，ALT复常为83%，病毒学耐药为2%；而24周时HBVDNA>104copies/ml组进续治疗至104周时，HBVDNA<QL仅为20%，血清转换率6%，而病毒学耐药率高达30%（HBeAg阳性）和60%（HBeAg阴性）。说明24周时病毒抑制强度可作为预测104周时治疗应答和耐药发生的指标，从而为及时调整用药提供参考。
        美国Keeffe E.B等12位肝病专家通过分析26篇前瞻性临床文献共3400多例患者的资料，根据治疗过程中对HBVDNA、HBeAg/抗HBe和ALT动态监测，提出了路线图概念，一致认为定量监测治疗后HBVDNA水平是预测疗效和耐药的最好指标[20]。根据路线图概念，开始治疗后12周对患者病毒学应答进行初次评估，若HBVDNA下降<1 log10 IU/ml,则定义为原发治疗失败，对那些并非由依从性导致原发治疗失败患者应改变治疗方案。监测血清HBVDNA的下一个重要时间点是治疗24周时。根据24周时应答情况，分为完全病毒学应答、部分病毒学应答和不充分病毒学应答。完全病毒学应答即HBVDNA <60 IU/ml（300copies/ml），（标准PCR法检测下限）。这些患者可继续服用原来药物，随访监测间隔可逐渐延长至6个月。部分病毒学应答即第24周时HBVDNA≥60 IU/ml且<2000 IU/ml，（即≥300copies/ml且<104copies/ml），此时应加用一种无交叉耐药的药物，以防止耐药和病毒反弹的出现，并加强监测。不充分病毒学应答即第24周时HBVDNA≥2000 IU/ml（≥104copies/ml），此时应调整治疗方案，改用一种作用更强的药物或加用一种无交叉耐药的药物，并加强监测。
        在美国肝病研究学会（AASLD）2007年年会上Gish R 教授对路线图提出补充，认为应根据不同核苷类似物抗HBV特性、耐药特性，选择不同的决策时间点来决定后续治疗方案。拉米夫定耐药率高，治疗3个月时如应答不佳应改用或加用第二种药物，替比夫定为6个月，阿德福韦为1年。恩替卡韦因耐药性极低，如治疗2年患者应答不佳可考虑调整治疗方案[21]。
        在临床实践中应用路线图可有效加强对慢乙肝患者治疗管理，提高质量效果，减少耐药。但在2008年3月在北京举行的乙肝抗病毒耐药策略研讨会上，日本Masao Omata教授对路线图概念提出质疑，认为路线图概念可能使患者不必要地暴露于发生耐药突变的危险中。 
按照路线图初治采用高耐药药物，导致24周时早期加药，会影响后期治疗。他坚持起始治疗一定要强效抑制病毒复制，尽快达到PCR不可测水平，不给HBV发生突变提供机会，才能预防耐药发生。即使治疗5-10年后再加药，即晚期加药，这种策略能维持更长治疗时间[16]。
        （3）耐药发生后——挽救性治疗
        Lok A S指出[8],对HBV耐药患者的治疗要了解既往病史、治疗应答情况、检测的病毒突变模式及对不同药物的敏感性，及时换用或加用与原用药无交叉耐药的药物进行挽救性治疗。Lampertico P[22],Yun Fan Liaw[23]等均认为，在基因型耐药阶段，HBVDNA尚未明显反弹到过高值时就及早调整药物，可收到更迅速持久的效果。
        拉米夫定耐药：临床应用拉米夫定10年来，其耐药问题日益受到重视。大量资料表明，阿德福韦酯对拉米夫定耐药患者有明显效果[22-25],但随着用药时间延长亦出现阿德福韦耐药问题，拉米夫定耐药序贯单一阿德福韦治疗患者，对阿德福韦耐药发生更早，发生率更高，48周达18%,104周达25%[26,27]。因此，近年研究结果证实，对拉米夫定耐药患者挽救性治疗不是序贯换用阿德福韦，而是采用拉米夫定加阿德福韦联合疗法[8,23-25,28],经3年观察未发生阿德福韦基因型耐药，可持久预防病毒学反弹和临床耐药。
        替比夫定耐药：同拉米夫定耐药处理。
        阿德福韦耐药：加用拉米夫定，或改用恩替卡韦（如果以前无拉米夫定耐药）[8]。
        恩替卡韦耐药：加用或改用阿德福韦[8]。
        总之，慢乙肝治疗要按照个体化情况，优化选择合理使用核苷类药物，参照路线图加强 HBVDNA检测。尽早发现基因型耐药或病毒学反弹，及时采取干预措施，调整治疗，争取最好治疗效果。