白花丹素的体外肝毒性研究
2.5 MTT法测定白花丹素的肝毒性按“2.4”项下方法在96孔培养板中加入人胚肝细胞L-O2悬液。待细胞完全贴壁后，实验孔加入系列浓度白花丹素20 μl每个浓度设3个复孔，并设阴性对照孔和空白对照孔。培养箱孵育24，48 h，同法测定白花丹素对人胚肝细胞L-O2的抑制率，计算平均抑制率及IC50值。
2.6 紫外分光光度法测定细胞培养上清液中的SOD，MDA，LDH值取对数生长期的人正常胚肝细胞L-O2用胰酶消化后，用RPMI-1640培养液吹打制成细胞悬液加入6孔培养板，每孔1.9 ml，在5％CO2,37℃培养箱培养24 h待细胞完全贴壁后，实验孔加入125 μg·ml-1白花丹素标准品0.1 ml，另设空白对照组。在药物作用的12，24，48 h后，取培养液的上清液按SOD，MDA，LDH试剂盒中所述方法进行SOD，MDA，LDH的测定。
2.7 统计学软件处理数据数据以±s表示，采用SPSS13.0软件进行处理。采用Bliss法求算IC50值。
3 结果
3.1 MTT法测定结果白花丹素组与空白对照组比较，在31.25～500 μg/ml浓度范围内，吸收度A值随药物浓度的增加逐渐减小，说明白花丹素对肿瘤细胞增殖有显著抑制作用，且具有剂量相关性。结果见表1。同时白花丹素具有一定的肝毒性。结果见表2。表1 白花丹素对肿瘤细胞的IC50值（略）表2 不同时间白花丹素L-02细胞株的毒性测定结果（略）
3.2 SOD，MDA，LDH测定结果用紫外光光度法测定培养上清液中的SOD、MDA、LDH值。结果见表3。表3 紫外分光光度法测定白花丹素对肝细胞的毒性作用（略）
4 讨论
肝脏是外源性化学物质代谢的重要器官，在药物众多靶器官中无疑是最重要的，因此研究外源性化学物质对肝的影响是毒理学研究的重要组成部分［4］。研究药物肝毒性的传统方法多采用动物实验，但动物实验所需样品和动物量大，提取、分离并纯化大量中药成分比较困难，实验成本高。近年来，多种体外细胞培养体系已成为研究的有力工具，用培养细胞进行体外毒性分析已发展为早期毒性评价的重要替代方法，在中药新药开发早期建立有效的体外评价体系更是高通量筛选的手段之一［5］。本实验中，我们选取了来源体的人胚肝细胞L-O2为试验对象，考察白花丹素在体外对正常细胞的毒性作用。细胞建株通过在体外若干次的传代培养后基本可以消除不同人群的个体差异，具有很强的代表性，能切实反映出白花丹素的体外肝毒性。
本实验结果表明白花丹素对人肝细胞L-O2有一定的毒性作用，且其抑制细胞生长随药物浓度的增加而增高。试验中白花丹素对肿瘤细胞 IC50值平均为45.24 μg·ml-1，对人正常胚肝细胞L-O2 IC50值为108.713 μg·ml-1。白花丹素对肿瘤细胞毒性选择指数（SI）为2.403，这说明白花丹素对肿瘤细胞具有一定的选择性毒性作用，对肝毒性较小。作为一个抗肿瘤药物，具有较大的抗肿瘤活性，较低的毒性才能在临床上得到应用，本实验结果可为该药的研究提供参考。
国外有报道［6］，白花丹素可通过抑制启动阶段或启动后阶段致癌剂诱导的细胞过度增殖而对大肠癌具有预防作用。Srinivas等［7］研究了白花丹素诱导子宫癌细胞ME-180凋亡的作用及其可能机制，结果显示白花丹素可明显抑制ME-180细胞增殖，其可能机制是通过刺激ME-180。细胞内活性氧产生、损伤线粒体，使其膜电位下降，引起ME-180细胞凋亡，而且ME-180细胞凋亡率与白花丹素浓度呈正相关性。白花丹素抗肿瘤机制至今未有明确报道，可能与自由基有关，细胞受到氧化损伤时，自由基及其过氧化反应产物破坏细胞膜和细胞结构，导致细胞肿胀坏死，细胞内清除自由基酶的活性下降，导致其清除自由基能力下降，使肝细胞损伤进一步加重，膜通透性增高，肝细胞内重要物质LDH，MDA外泄［8］。据此，我们采用人胚肝细胞L－O2，以抗肿瘤药物白花丹素诱导肝细胞损伤为模型，通过测定白花丹素作用后的肝细胞为实验组，证明其机制可能与拮抗自由基产生，加强其清除和保护抗氧化酶活性有关。
【参考文献】
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