相关序列扩增多态(SRAP)在农作物遗传育种中的应用

　　摘要:相关序列扩增多态(SRAP)是近几年发展起来的新型分子标记技术,具有简便、稳定、高共显性、易于得到选择条带序列等优点。阐述了SRAP的原理和流程,论述了SRAP在作物遗传图谱的构建、遗传多样性、基因定位等方面的研究进展及应用前景。
　　关键词:相关序列扩增多态;原理;遗传图谱;遗传多样性;基因定位

　　AbstractSequence-Related Amplified Polymorphism(SRAP) is a new kind of DNA molecular markers,which possesses characteristics such as simplicity,reliability,high co-dominance and easily getting sequence of selected bands. SRAP principles and protocols were described and its research advances and application in such aspects as genetic mapping,genetic diversity,gene tagging and so on were overviewed.
　　Key wordsSequence-Related Amplified Polymorphism;principles;genetic mapping;genetic diversity;gene tagging
　　
　　我国有丰富的农作物品种,但天然品种总是在某些性质方面存在缺陷,如容易受到病虫害感染、产量低等。因此,选育和推广优质的农作物新品种是农作物研究的重要任务。分子标记辅助育种是利用分子遗传标记,借助于目标基因紧密连锁的遗传标记的基因型分析鉴定含有目标基因的个体,从而提高选择效率,减少盲目性,加速育种进程,在一定程度上弥补了传统育种缺陷[1]。
　　目前,用于植物基因组分析的分子标记有RFLP(restr-ication fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)、RAPD(random amplified polymorphic DNA,随机扩增多态性DNA)、AFLP(amplified fragment length polymorphism,扩增片段长度多态性)、SSR(simple sequence repeat,简单重复序列)、SRAP(sequence-related amplified polymorphism,相关序列扩增多态)等。其中RFLP标记虽然以共显性方式遗传,但由于它对DNA需求量大、实验操作较繁琐、检测周期长、成本费用高等限制了其广泛引用;RAPD方法虽然简单易行,需DNA量极少,但由于RAPD标记是一个显性标记,不能识别纯合子和杂合子,且其操作重复性较差;SSR具有高度的多态性、共显性遗传、选择中性、易于操作等优点,但SSR座位的筛选和特异引物的开发工作繁琐且耗时费力,限制了其广泛应用;AFLP技术发挥了检测位点多、多态水平高、灵敏度高、结果稳定可靠等优点,但其操作要求严格,扩增时会有假阳性和假阴性结果以及凝胶背景杂乱等缺点,在一定程度上影响了其标记作用的良好发挥;而SRAP是一种新型的基于PCR的标记技术,它的特点在于不需要知道任何基因的序列信息即可进行PCR扩增,集中了上述几种标记技术的优点,具有共显性、简便、稳定、操作简单、重复性强、中等产率等优点,可以弥补以上各项技术的不足,在多种植物研究中得到了广泛的应用,体现了SRAP标记技术在植物研究中的可行性。
　　1SRAP标记简介
　　SRAP标记是由美国加州大学作物系Li[2]于2001年在研究芸薹作物时开发出来的一种标记技术,在油菜、水稻、小麦、棉花等农作物上的研究已体现出一定的应用价值[3-7]。
　　1.1SRAP标记原理
　　SRAP主要对植物基因组中ORFs(open reading frames,开放阅读框)进行扩增,利用外显子富含GC而启动子、内含子富含AT的特点设计引物。上游引物(也叫正向引物,forward primer)长17 bp,引物的3′端为3个选择碱基,引物的5′端为14 bp的核心序列,由一段填充序列和CCGG构成,主要结合在外显子区域,对外显子进行特异扩增。下游引物(也叫反向引物,reverse primer)长18 bp,引物的3′端仍为3个选择碱基,引物的5′端为14 bp的核心序列,其中核心序列前11 bp是一段填充序列,紧接着是AATT,下游引物的结合位点在内含子区域或启动子区域,对内含子区域、启动子区域进行特异扩增。由于内含子、启动子与间隔序列长度在物种间或同一物种的不同个体间是不等的,因此用SRAP分析时会产生多态性[2]。
　　1.2DNA扩增
　　DNA扩增采用复性变温法扩增,主要是为了保证引物与靶DNA配对,并且保证扩增片段的重复性。反应体系中包括DNA 150 ng、dNTPs 0.2 mmoL/L、1.5 mmoL/L MgCl2、0.3 μmoL/L引物、1 U TaqDNA聚合酶。反应参数:94 ℃预变性5 min;循环30次,前5次循环:95 ℃变性30 s,35 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s;后25次循环:94 ℃变性30 s,50 ℃复性30 s,72 ℃延伸30 s,循环结束后72 ℃延伸7 min[8]。不同的物种进行SRAP-PCR扩增的最优条件并非相同,因此在进行具体研究时应对PCR中反应体系进行优化,对相关参数做浓度梯度研究以确定研究对象的最优扩增条件,达到最好的反应效果[9]。
　　1.3产物检测
　　扩增产物通常用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,也可用琼脂糖检测多态性。分离完毕后用放射自显影方法、银染方法或EB方法检测[8]。
　　2SRAP技术在农作物遗传育种中的应用
　　近年来,由于SRAP引物的大量开发,并且在分子标记辅助育种中体现出了优于AFLP、ISSR、RAPD等特点[10-11],因此备受遗传育种学家的青睐,被广泛应用于农作物遗传多样性评价、遗传图谱构建和品种鉴定等方面。