疯牛病研究进展

　　3.4PrPSC的神经毒性研究
　　TSE的共同病理学特征是神经纤维网的空泡化,严重的神经胶质过多症,神经元变性。通常在患传染性海绵状脑病的动物脑部都可以看到正常细胞PrPC的异构体PrPSC的大量积聚。PrPC是一个广泛的膜蛋白,其高度集中在中枢神经系统的神经元和神经胶质细胞上,但对其功能了解的还不是很清楚。PrPC病理异构体PrPSC仅能被蛋白酶部分地降解,产生一个蛋白酶抗性、27-30Kda大小(PrP27-30)的核心肽段,PrP27-30聚合成棒状纤维并聚集于神经组织,通过引发激活凋亡程序和星形胶质细胞增生,导致神经元死亡。虽然PrPSC被认为是TSE传染和致病因素,但是那些缺乏PrPSC积聚的自然病例和实验病例的现象表明,PrPSC在大脑中的沉积不是神经变性所必需的因素,而且将PrPSC制备物注射到PrP基因敲除鼠大脑内不引起该鼠致病和神经元的损害,这些试验结果揭示PrPSC无直接的毒性,并支持TSE的病理发展需要PrPC和PrPSC 2种蛋白构象存在的说法。尽管对PrPSC神经毒性已进行很多方面的研究,但其致病机理还没有完全弄清。但近年来,利用PrP106-126和PrP118-135作为模型对PrPSC神经毒性机制的研究已取得一些成效。
　　PrP106-126相应于人PrPC序列106-126残基KTNMK HMAGAAAAGAVVGGLG,这是一段高度保守和无结构区域[7]。PrP106-126被认为是主要负责PrPC的纤维状结构转变的区段。这个肽段已被证明是揭示PrPSC毒性机制的合适工具,因为其在体外具备PrPSC的大部分病理特征,PrP106-126在体外倾向于聚集成β-折叠结构,形成淀粉样纤维,并具有部分的蛋白酶抗性。而且有报道称,该肽能诱导原代培养的海马神经元、皮质神经细胞和小脑神经细胞凋亡以及对胶质神经细胞发挥营养作用,特别是和PrPSC一样通过调控电压敏感性钙离子通道,Caspase(半胱氨酸天冬氨酸裂解酶,Cysteine—requiring Aspartate protease)和P38有丝分裂原激活蛋白(mitogen—activated protein,MAP)激酶活性导致凋亡细胞死亡。而且神经细胞和胶质细胞能吸收该肽,以及PrP106-126对不表达细胞PrP来源的神经元没有毒性,这说明该肽段的毒性能够反映TSE PrPSC的致病机制,这样PrP106-126成为研究朊蛋白依赖性神经细胞毒性的合适模型。
　　PrP106-126活性由其疏水域调控。当其疏水端变异后,PrP106-126变异体的β-折叠含量和细胞毒性均有显著的下降。PrP106-126序列的114和119位置的甘氨酸是该肽微纤维生成的主要决定因素。Gly114和Gly119被丙氨酸取代(PrP106-126AA)后,该肽的灵活性降低,导致可溶性β结构肽的形成,而且PrP106-126 AA片段在与成神经瘤细胞一起孵育时,会像野生型PrP106-126神经毒性原纤维中间体一样具有很高的神经毒性[8]。
　　3.5异常朊蛋白(PrPSC)的形成和增殖
　　1997年Stanley Prusiner 在疯牛病的研究中提出疯牛病的传染完全是朊蛋白的作用而没有其他基于RNA或DNA的作用,提出“蛋白质唯一论”,显然这与通过DNA 或RNA 的作用实现传染的传统概念截然不同。“蛋白质唯一论”的实质就是疯牛病的传染是通过信息从异常朊蛋白流向正常蛋白的过程。
　　目前有2种模式来解释PrPSC生成过程[9]:一是模板介导的转换过程,即重折叠模式:①PrPC变成PrPSC的过程是一个解折叠与重折叠的过程,需要很高的能量,通常是不会发生的。②PrPC发生某些变异后,能以极低的频率(1/106)转变成PrPSC,这就是家族性CJD发生的原因。③外源性PrPSC能促进PrPC向PrPSC的转变,并在此过程中充当模板,此外还需要一种酶或称伴侣蛋白的参与,以降低能量需要。二是核依赖的聚合过程即种子模型或结籽模型:①PrPSC与PrPSC存在一种不对称的平衡状态,强烈偏向PrPC方向;只有当PrPSC结合到多聚PrPSC形成的晶体“种子”上,才具有稳定性。②自然条件下“种子”的形成是小概率事件,然而一旦出现,就会加快单体PrPSC的凝聚(表面积加大的原因)。③大量外源性PrPSC的进入,有利于种子的形成,从而促进大量内源性PrPSC的产生与聚集,甚至形成不同的淀粉样纤丝。
　　PrPSC生成的前提条件是存在PrPC与PrPSC之间的相互作用。在体外转换试验中,PrPSC可诱导35S标记的PrPC向类似PrPSC的结构变化。转换效率依赖于加入PrPSC的浓度、时间等。重组朊蛋白PrPC的解折叠和再折叠过程也为PrPSC生成提供有益的信息。中性条件下,PrPC折叠符合双态折叠模式。但在酸性条件下,检测到含β-折叠的中间体。在另一方面,发现在酸性和还原条件下可形成富含β-折叠、对蛋白酶消化具有抵抗能力的单体形式。
　　关于朊毒体的增殖,比较合理的解释就是“晶种学说”[10],基本内容就是PrPSC可以与PrPC形成一种聚合体,由于结合导致PrPC的空间结构发生改变,导致其α螺旋减少,更多的变成β-折叠,然后聚合体一分为二,变成2个PrPSC。这种反应具有厄尔尼诺效应,已发生转变的分子又可使其他正常分子发生转变。虽然起初随机反应可能达不到致病作用,一旦出现此类转变之后,会发生自动催化反应,使PrPSC呈指数形式剧增,最后使动物体发病。
　　4参考文献
　　[1] OIE.International Animal Health Code[M].France:Ninth Edition,2000:231-238.
　　[2] HARRIS D.Mad cow disease and related spongiform encephalopathies[M].New York:Springer- verlag Berlin Heidelberg press,2004.
　　[3] ARANHA H,MARTIN.Potential prion risks and clearance by filtration[J].Genetic engeneering news,2001,21(11):58.
　　[4] ALDRIDGE SUSAN.Novel BSE test systems[J].Genetic engeneering news, 2001,21(6):1.
　　[5] FINBERG KE.Mad cow disease in the United States:an update on bovine spongiform encephalopathy and variant Creutzfeldt-Jakob disease[J].Clinical Microbiology Newsletter,2004,26(15):113-118.
　　[6] FISCHER M B,ROECKL C,PARIZEK P,et al.Binding of disease-associated prionprotein to plasminogen[J].Nature,2000(408):479-483.
　　[7] SCHMERR M J,JENNY A L,SBULGIN M,et al.Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with atransmissible spongiform encephalopathy[J].Chromatogr A,1999(853):207-214.
　　[8] SHAKED G M,SHAKED Y,KARIV-INBAL Z,et al.A Protease - resistant Prion Protein Isoform Is presentin Urine of Animals and Humans Affected with Prion Diseases[J].Biol Chemhen,2001(276):31479-31482.
　　[9] BIESCHKE J,GIESE A,SCHULZ-SCHAEFFER W,et al.Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(10):5468-5473.
　　[10] GABRIELA P,SABORIO,BRUNO P.Claudio Soto Sensitive detection of pathological prion protein by cyclic amplification of protein misfolding[J].Nature,2001(411):810-813.