疯牛病研究进展

                      作者：毕邹生 姚静 王纪芬 冒衡

　　摘要自20世纪80年代中后期英国第1次大规模暴发的疯牛病以来,随后在多个国家也相继出现疯牛病病例,疯牛病严重影响着各国经济贸易的发展,并且严重威胁着人类的生活健康。分析疯牛病的临床特征、病原学、发病机理,以为疯牛病的防治提供参考。
　　关键词疯牛病;病原学;发病机理 　　
　　疯牛病(BSE)是一种传染性海绵状脑病(Transmissible spongiform encephalopathies,TSE),是由正常朊蛋白(PrPC)异构为异常朊蛋白(PrPSC)而引起的发生于一些哺乳动物的一种致死性神经退行性疾病。羊痒病(SC)是第1个被认识的朊毒体病,之后人们在动物上相继发现了牛海绵状脑病(即疯牛病)(BSE)、传染性水貂病(TME)、杂种鹿和驼鹿的慢性消瘦病(CWD)和猫海绵状脑病(FSE)。现已发现的人类朊毒体病有克雅氏病(CJD)、新克雅氏病(NCJD)、库鲁病(Kuru-Disease)、格斯特曼综合症(GSS)和致死的家族性失眠症(FFI)。
　　1疯牛病的发展历史
　　动物的海绵状脑病在很早就有记载,18世纪中叶羊痒病(Scrapie)在欧洲被观察到。1986年,疯牛病最先在英国暴发。据OIE官方统计,至2008年9月,英国共确诊BSE病牛达184 575头,在1993年达到最高峰[1]。尽管目前疯牛病发病机理尚未完全清楚,但人们普遍认为是牛食用染有羊痒病毒的肉骨粉饲料而引发疯牛病。随着肉骨粉在养殖业的停止使用,现在每年的暴发数量呈下降趋势。由于很多国家,特别是欧盟国家都曾从英国进口活牛或肉骨粉等饲料产品,这就使疯牛病不仅仅只在英国暴发。1989年,疯牛病第1次出现在英格兰以外的国家冰岛。尽管疯牛病在这些国家的传播速度远逊于英国,但到2008年时,欧洲共21个国家出现疯牛病(包括英国),美洲的美国和加拿大也出现。2001年,疯牛病第1次出现在非欧美洲国家日本。尽管各国均采取强有力的政策措施控制疯牛病的传播。但目前,欧洲、北美洲、亚洲都不同程度上出现疯牛病,疯牛病的暴发风险并没有完全消失[2]。
　　2临床表现
　　医学家们发现BSE的病程一般为14～90 d,潜伏期长达4～6年。这种病多发生在4岁左右的成年牛身上。其症状不尽相同,多数病牛中枢神经系统出现变化,行为反常,烦躁不安,对声音和触摸尤其是对头部触摸过分敏感,步态不稳,经常乱踢以致摔倒、抽搐。发病初期无上述症状,后期出现强直性痉挛,粪便坚硬,两耳对称,性活动困难,心搏缓慢(平均50次/min),呼吸频率增快,体重下降,极度消瘦,以致死亡。经解剖发现,病牛中枢神经系统的脑灰质部分形成海绵状空泡,脑干灰质两侧呈对称性病变,神经纤维网有中等数量、不连续的卵形和球形空洞,神经细胞肿胀成气球状,细胞质变窄[3]。另外,还有明显的神经细胞变性及坏死。
　　3病原学及其致病机理
　　3.1朊蛋白的基因结构及生理作用
　　正常朊蛋白主要分布在动物神经元细胞表面,是机体正常表达的一种铜结合糖蛋白,由单拷贝染色体基因的单一外显子编码[4]。人类、小鼠和牛编码的PrP基因分别位于第20、2、13 号染色体上。研究发现,朊蛋白的作用可能与神经系统的维持有关。PrPC敲除试验表明,除去PrPC的动物,可导致与昼夜节律有关的行为异常。另外,已发现PrPC具有类似Cu/Zn-SOD的活性,可清除超氧自由基;PrPC可调节胞内钙平衡,PrPSC侵染的细胞内可发生钙紊乱。另外,朊病毒的神经毒性片段106~126可与细胞膜上特定的离子通道相互作用,引发膜内外电位变化,从而打破胞内外钙离子浓度的平衡。
　　3.2朊蛋白(PrPC)与朊毒体(PrPSC)的比较
　　正常表达的朊蛋白(PrPC)构象的二级结构中α螺旋占42%、β折叠占3%;而异常构象朊蛋白的α螺旋占3%、β折叠占43%,具有强致病性。PrPC和PrPSC的一级结构没有差别,正常动物脑中只有PrPC没有PrPSC,PrPC和PrPSC间由α螺旋向β折叠的转变即朊病毒蛋白的形成过程。致病性朊粒对一些理化因素的抵抗力非常强,大大高于已知的各类微生物和寄生虫,加热到360 ℃仍有感染力,植物油的沸点为160～170 ℃,不足以灭活病原,患病牛的脑组织匀浆,经134～138 ℃高温维持1 h后,动物实验仍有感染力。且还耐甲醛、耐强碱,患病牛的脑组织能耐受1.2 mol/L的氢氧化钠达2 h。正常朊蛋白可以被蛋白酶K分解,但患病牛大脑中的这种蛋白结构发生改变,并聚集成淀粉样的纤维杆状结构,因而不能被蛋白酶分解。变构异常蛋白会凝聚在一起,沉积在大脑中,引起神经细胞退行性病变[5]。
　　3.3PrP的多态性
　　研究发现一些朊病毒基因突变与朊病毒疾病的自发性、潜伏期长短及抵抗性有关。特别是在人类中,虽然大部分朊病毒疾病是散发性的,但大约有10%是与朊病毒基因突变有关的家族性朊病毒疾病,如GSS病、致死性家族失眠症、家族性克—雅氏症等。
　　人的遗传性朊病毒病和PrP基因的点突变有关。PrP 102位Pro→Leu突变是第1个被确定与GSS自发产生有关的突变,后来又相继发现一些突变,如105位Pro→Leu突变,117位Ala→Val突变,198位Phe→Ser突变,217位Gln→Arg突变,这些突变与GSS的自发产生并形成遗传性有关。145位密码子突变成终止密码子,这一琥珀型突变导致合成一个截短型的PrP分子,这和非典型形式的GSS相关,这种GSS临床过程像阿尔兹海默症(Alzheimer),200位Glu→Lys突变,210位Val→Ile突变,232位Met→Arg突变与散发性和家族性克—雅氏症形成有关;178位Asp→Asn突变与致死性家族失眠症形成有关;而129位Met→Val突变是一个多态性位点,本身并不引发疾病,只是协同178位Asp→Asn突变引发疾病。
　　绵羊PrP开放阅读框的几个多态性和朊病毒病的表现型差异相关,如潜伏期、病理和临床症状。绵羊PrP氨基酸的多态性位于112(Met→Thr)、136(Ala→Val)、137(Met→Thr)、138(Ser→ Asn)、141(Leu→Phe)、151(Arg→Cys)、154(Arg→His)、171(Gln→His或Gln→Arg)和211(Arg→Gln)。山羊PrP氨基酸在密码子142(Ile→Met)、143(His→Arg)和240(Ser→Pro)具有二态性。只有密码子142(Ile→Met)和疾病的潜伏期有关。绵羊PrP在171位的Arg/Glu多态性可能与羊痒病潜伏期调控相关。而基因型AA136、RR154、RR171对自然、实验感染痒病及BSE具有抗性。
　　人的遗传性朊病毒病也和插入性突变有关。PrP基因插入突变由1到9个,但没有插入3个的,额外的八肽(octapeptide)重复序列,插入位置在PrP基因的51～91密码子之间。正常的这个区域由1个九肽(nonapeptide)(R1)接着4个八肽(R2,R2,R3,R4)组成:pqggggwgq—phgggwgq—phgggwgq—phgggwgq—phgggwgq,它们有相似的氨基酸序列,但可从DNA序列的变异来区分。有报道称5~9个额外的八肽重复意味着朊病毒病常染色体的显性遗传方式和很多的不同表型。相反,1、2或4个的额外插入通常表现为典型的CJD。这种类型突变的患者通常没有神经失调的家族病史。PrP基因1～4个额外的八肽重复序列的插入突变引起的CJD,主要在60岁后发病,病程发展迅速,最后在几个月内死亡。对于羊而言,PrP的八肽重复仅有3个而不是通常的5个的变异,这和绵羊、山羊痒病的潜伏期变长有关。牛PrP基因包含5或6个短的,富含G—C的序列编码八肽PHGGGWGQ或更长的变异形式:PQ/HGGGGWG重复序列。在Goldmann报道的12头牛中,有8头富含Gly八肽的6拷贝纯合基因(6∶6),4头杂合子(6∶5)。有2例BSE是纯合子(6∶6)形式。Goldmann等报道的山羊PrP八肽基因序列只有3个重复,它们编码短肽重复为:Pro—Gln/His—Gly—Gly—Gly—(Gly)—Trp/Gly—Gln,并在102位密码子,由编码Gly的密码子置换成Trp的密码子。这些山羊至少在4年内未见有疾病症状。小鼠和仓鼠的PrP基因也都含有多个拷贝的G—C重复序列,且都缺乏TATA框。这些G—C九聚体作为一个模体,可能是转录因子SP1的结合位点[6]。