食源性病原菌检测方法研究进展

　　1.4免疫金技术
　　1.4.1原理与特点。胶体金标记抗体,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。增菌的阳性样品沿着膜移动,被固定的载有染色剂的抗体将使抗原—抗体复合物着色,显色程度与抗原含量成正比。其特点是灵敏度和特异性都较高,且操作简便、快速,无污染,易于判读。用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。金标免疫快速试验的灵敏性与ELISA基本相近,许多试验的敏感度都可达到1 ng/mL或更低水平,但是有些试验则不能达到如此的敏感度,采用信号放大系统如生物素—链亲和素系统,应用链亲和素与生物素结合的四价性和极高的亲和常数,可明显提高灵敏度和稳定性[2]。
　　1.4.2应用。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学,将抗沙门氏菌抗体与胶体金结合,用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原获得成功。进入20世纪90年代,它已在生物医学各领域得到日益广泛的应用。目前有专门用来检测食品及环境中沙门氏菌抗原、李斯特菌抗原的商品化检测卡。
　　2分子生物学检测方法
　　聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法,在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增。其大量研究表明,PCR在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度,而多数情况下则表现出更高的灵敏度,阳性检出率更高[3],而且检测周期大为缩短。在PCR的不断发展和应用中,以其为基础的更多方法技术涌现出来,其中,多重PCR、 DNA指纹图谱技术、荧光PCR、基因芯片技术、定量PCR等检测技术应用最为广泛。
　　目前部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。主要有:BioControl公司的肉毒梭菌、大肠杆菌0157:H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名Probelia)和Qualicon公司的大肠杆菌0157:H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名BAX)等。
　　2.1多重PCR检测技术
　　2.1.1原理与特点。多重PCR的建立,实现了多种食源性致病菌的同时检测。多重PCR是指在同一个反应体系中,加入多对特异性引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,即可同时在同一反应管中扩增出1条以上的目的DNA片段,达到一次性检测多种致病菌的目的。多重PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂使用量[4]。但也存在明显的不足,例如扩增效率不高、敏感性偏低;扩增条件需摸索与协调;可能出现引物间干扰等。
　　2.1.2应用。Franket等[5]首先将多重PCR方法检测产毒素性大肠杆菌基因。现多重PCR方法已被用于同步检测大肠杆菌、沙门氏菌、致病性弧菌等[6],鉴定与肠毒素有关的金黄色葡萄球菌菌株[7],研究李斯特菌种内分化等,结合富集培养,应用多重PCR方法甚至可以同时检测13种不同的食源性病原微生物。
　　2.2DNA指纹图谱技术
　　2.2.1原理与特点。DNA指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱,使目标微生物的核酸经PCR扩增后产生多条DNA扩增片段,这种电泳图谱多态性丰富,具有高度的个体特异性和环境稳定性。指纹图谱是鉴别菌种、种属的有力工具,具有快、准确等优点。其中包括随机引物扩增多态性DNA分析(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD),主要用于不考虑微生物核酸精确序列的情况下,比较微生物间的DNA指纹图谱差异,用于细菌种间的鉴定、微生物的分子分型和鉴定。
　　2.2.2应用。国内有的机构采用RAPD技术对肠炎沙门菌进行分子分型,先将肠炎沙门菌接种SS平板并取其菌液作为RAPD多态性分析的DNA粗制模板,然后利用引物5’-CCGCAGCCAA-3’对菌株进行RAPD扩增反应并经过凝胶成像系统获得RAPD图像,再用软件计算扩增片段的分子量大小和系统聚类分析。该方法为肠炎沙门菌食源性疾病的流行病学调查和溯源的同源性分析提供了技术支持。但是RAPD的不足之处是需对大量的随机引物进行筛选。
　　2.3实时荧光定量PCR
　　2.3.1原理与特点。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中在探针上加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法,且自动化程度高,目前已得到广泛应用。
　　2.3.2应用。我国科学家彭雁忠等(2005)已建立了一种能同时检测空肠弯曲菌(CJ)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7、副溶血性弧菌(VP)和单核增生李斯特菌(LM)的多联实时荧光PCR定量方法。
　　2.4DNA芯片技术
　　2.4.1原理与特点。DNA芯片是将大量寡核苷酸分子固定于固相支持物上组成的微点阵列。其检测致病菌原理为:选择细菌的共有基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC)作为靶基因,用1对通用引物进行扩增,再利用芯片上的探针检测不同细菌在该共有基因上的独特碱基。最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式区分不同的细菌,此法还可以通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应的探针来逐步扩大基因芯片的检测范围。并通过增加和调整探针来逐步提高基因芯片的准确性。在食品卫生质量检验、临床疾病诊断方面微阵列基因芯片的开发具有广阔的应用前景[8]。
　　2.4.2应用。Carl等[9]在对4种细菌,即大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌和空肠弯曲菌采用基因芯片的检测方法,其检测结果不仅敏感度高于传统方法,而且操作简单,重复性好,并且节省了大量时间,大大提高了4种细菌的诊断效率。2001年,Call等[10]利用多重PCR和基因芯片技术成功检测了大肠杆菌O157:H7。聂萌(2006)运用通用芯片技术平台建立了快速、准确、高通量检测食源性致病菌的方法。然而,基因芯片技术还有许多地方待改进,如检测成本高昂,检测特异性有待提高,样品制备过程应该进一步简化以及建立标准化程序等。
　　3生物传感器
　　3.1原理与特点
　　生物传感器主要由分子识别的固定化生物敏感膜和转换信号的换能器2部分组成。当待测物质经扩散作用进入固定化敏感膜时,发生生物学反应,产生的信息被相应的转换器转变成可定量和可处理的电信号,并经仪表放大输出,以电子计算机处理后,即完成对产生信号的检测,由此获得待测物质的种类及浓度。与传统的化学传感器和离线分析技术相比,生物传感器有着许多不可比拟的优势,如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本,可微型化、便于携带、可以现场检测等。
　　3.2应用
　　乌普迪克等(1967)制出了第1个生物传感器葡萄糖传感器。在第2代生物传感器(微生物、免疫、酶免疫和细胞器传感器)的基础上,国内外学者正研制和开发第3代生物传感器,是将生物技术和电子技术结合起来的场效应生物传感器。Liu等[11]用光学免疫传感器实现了鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。Geng等[12]采用了以抗体为基础的光纤免疫传感器对热狗和腊肠内少量的单增李斯特菌进行检测,检测低限为10~1 000 cfu/g,可在24h内完成。在现场快速检测领域,生物传感器技术与比色、免疫胶体金试纸、ELISA等检测方法相比还未得到普遍应用,但国内外对这方面的报导很多,各种新技术如纳米、分子印迹为其提供了丰富的发展空间,随着检测仪器和检测方法的不断成熟,生物传感技术在食品现场快速检测领域将有更广阔的应用前景。