食源性病原菌检测方法研究进展

                作者：孙晓飞 赵凯 王金斌 谭芙蓉 祁保民 唐雪明

　　摘要食品中的病原微生物是影响食品安全的主要因素之一,传统检测食源性病原菌的方法繁琐复杂、周期较长,随着分子生物学技术和微电子技术等的发展,快速、简便、特异的检测方法成为研究目标。介绍并分析了几种检测食源性病原菌的方法及其特点,并就其发展历程和应用进行阐述。
　　关键词食源性病原菌;食品安全;检测方法
　　AbstractPathogenic microorganism is one of the most primary factor which impacts on food safety. The traditional methods for detection of foodborne pathogens are quite complicated,and exhaust a considerable amount of time. With the development of molecular biology and microelectronic technique,the detection technology which is fast,simple and specific becomes the research target. Several methods and feature for detection the foodborne pathogens were introduced and analyzed. Then its developmrent history and application were elaborated.
　　Key wordsfoodborne pathogens;food safety;detection technology
　　
　　农产品和食品安全是全球性问题,食源性疾病是食品安全的主要问题,世界卫生组织将其定义为:“凡是通过摄食进入人体的,使人体患感染性或中毒性的疾病。”这里包括了由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。近年来,国内外食源性疾病事件频频发生,如英国的疯牛病、日本的雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件,法国的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引发的食物中毒事件,全世界每年发生食源性疾病的有数十亿人,每年约有200万儿童死于腹泻。其中66%以上是由细菌性病原菌所致。其中动物源性食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血弧菌、单增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。因此,对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注。其中,食源性病原微生物的检测技术是预防与控制食源性疾病的关键技术环节。传统微生物检验方法的最大弱点是耗时较长,难以满足食品生产厂家特别是出口厂家检测期较短的需求。目前国内外学者进行了大量的研究,在以抗体和核酸为基础的检测方法方面不断取得进展,现将当前国内外实际应用的食源性病原微生物检测主要技术简要介绍如下。
　　1以免疫学反应为基础的检测技术
　　1.1免疫荧光标记
　　1.1.1原理与特点。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种。它以荧光素作为一种标记物标记抗体,依据荧光素所发出的荧光在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位,确定抗原性质,并利用定量技术测定含量。该法把血清学的特异性、荧光色素的敏感性集为一体,因此具有特异性强、敏感性高、速度快的优点。主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决,使结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂[1]。
　　1.1.2应用。始创于20世纪40年代初,1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体,检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光素,Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进,从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。1994年我国科学家孙洋等人成功利用此法检测沙门氏菌。
　　1.2酶联免疫吸附测定
　　1.2.1原理与特点。酶联免疫吸附测定是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理结合起来的一种检测技术,通过显色进行定位和定量分析。具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、样品处理量大等特点,而且可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。
　　1.2.2应用。1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定用于IgG定量测定的文章,使得酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。Kryinski和Heimsch(1977)首次将ELISA用于食品沙门氏菌的检测,并在应用中不断得以发展,20世纪80年代Paadhye和许多学者都采用了ELISA进行食品沙门氏菌的检测,但他们使用的多价血清不同程度地存在交叉反应,使ELISA产生较多的假阳性,在实践中有一定的困难。20世纪80年代,单克隆技术问世和日趋成熟,文其乙等人(1995)在前人的基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和DE7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法,并形成了快速检测试剂盒,已被应用于各种畜禽疾病诊断和环境样品的检测,成为一种常规的检测方法。但到目前为止,大多数用于直接ELISA的抗体只具有属特异性。
　　1.3免疫磁珠分离法
　　1.3.1原理与特点。免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病菌发生特异性结合,载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病菌不断得到分离、浓缩,是从食品成分中分离靶细菌非常有效的方法。若能和其他检验方法如ELISA、PCR、FIA相结合,则可数倍地提高分离效率和检测范围。
　　1.3.2应用。如利用IMS技术对环境水样本进行检测,不进行过滤等预处理,能快速有效地探测环境中水的E.coli O157:H7,最低检测限可达2×103个细胞/mL;利用IMS-PCR法,可在7 h内在5~100 L样本中检测也至少1个C.parvum卵囊,该方法的快速性和灵敏性足以使其胜任饮用水中C.parvum污染的常规检测。在英国,此法主要应用于牛奶中E.coli O157:H7的监测和食品中单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌等的检测。