EGb761对慢性脑缺血大鼠脑组织神经胶质细胞的影响
【摘要】 目的 探讨EGb761(银杏叶提取物)对慢性脑缺血大鼠脑组织神经胶质细胞的影响。方法 将雄性SD大鼠随机分为假手术组、单纯缺血组、EGb761干预组。制备慢性脑缺血大鼠模型，药物干预12周后，免疫组化方法分别检测各组大鼠脑组织中星形胶质细胞和少突胶质细胞的表达。结果 EGb761干预组大鼠的海马、胼胝体、皮质CNPase阳性细胞表达明显高于单纯缺血组，而海马、胼胝体、皮质GFAP阳性细胞表达明显低于单纯缺血组(P<0.05)，差异有统计学意义。结论 慢性脑缺血时，EGb761对少突胶质细胞缺血性反应有保护作用，同时减少反应性星形胶质细胞增生。
【关键词】 EGb761;慢性脑缺血;少突胶质细胞;反应性星形胶质细胞增生;大鼠
【Abstract】 Objective To investigate the effects of EGb761(Ginkgo biloba extract) on neuroglial cell in chronic cerebral ischemia rats.Methods Male Sprague Dawley rats were randomly divided into shamoperated group, hypoperfusion group and EGb761 group. The models of chronic cerebral ischemia were established. Then the rats of EGb761 group were treated by intragastric administration with EGb761 for 12 weeks, the expressions of astrocytes and oligodendrocytes in the hippocampus, corpus callosum and cortex were examined by immunohistochemistry and the positive cells were counted.Results Compared with the hypoperfusion group, the number of oligodendrocytes increased and the number of astrocytes decreased significantly in the EGb761 group(P<0. 05).Conclusion EGb761 plays a protective role in oligodendrocytes ischemic reaction and decreases reactionary astrogliosis in chronic cerebral ischemia.
【Key words】 EGb761; Chronic cerebral ischemia; Oligodendrocytes; Reactionary astrogliosis; Rat
慢性脑缺血(chronic cerebral ischemia，CCI)与临床诸多脑血管疾病密切相关。慢性脑缺血时，少突胶质细胞存在易损性，而星形胶质细胞反应性增生、氧化应激和兴奋性毒性等是造成上述情况的重要原因。目前，有关标准银杏叶提取物EGb761(Ginkgo biloba extract 761)在脑缺血时对神经元保护作用的研究较多，而针对其对神经胶质细胞抗脑缺血作用的研究相对较少。本试验通过对慢性脑缺血大鼠模型给予国际标准含量的银杏叶提取物EGb761进行干预，观察其对少突胶质细胞及星形胶质细胞的影响，为慢性脑缺血的预防和治疗开辟新思路，提供实验证据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物与分组：雄性SD大鼠30只，体质量(220±30) g，由郑州大学实验动物中心提供。随机分成3组：A组为假手术组，B组为单纯缺血组，C组为EGb761干预组，每组10只。
1.1.2 药物与试剂：EGb761(达纳康，按国际标准银杏叶提取物要求选取，内含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯，40 mg/粒)，由法国博福益普生制药工业公司生产;GFAP抗体(胶质原纤维酸性蛋白抗体)、CNPase抗体(2’3’环核苷酸3’磷酸二酯酶抗体)，均购自北京博奥森生物技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 CCI模型鼠的制备：参考Wakita等[1]方法制备动物模型。10%水合氯醛(0.3 mg/100g)腹腔内注射麻醉后，颈部备皮、消毒，颈正中切开皮肤，切口1.5～2.0 cm，钝性分离筋膜、胸骨舌骨肌，分离出双侧颈总动脉，每侧用双线分别在近心端和远心端结扎，然后在两结扎处之间剪断颈总动脉制备出单纯缺血组和干预组模型，假手术组仅分离双侧颈总动脉而不结扎，缝合切口，对皮并消毒，放回原环境中饲养。
1.2.2 给药方法：将达纳康研成粉末状，用蒸馏水溶解并混匀，术后24 h按照0.5 ml/100 g予灌胃，单纯缺血组给予等量蒸馏水灌胃，各组灌胃均为1次/d，持续12周。
1.2.3 标本的收集与处理：大鼠经麻醉后，常规生理盐水及4%多聚甲醛灌注、固定，断头取脑，制作脑部冠状石蜡切片(厚度4 μm)，分别采用HE染色和免疫组化染色，检测脑组织病理变化和皮层、胼胝体及海马GEAP、CNPase阳性细胞数的情况。
1.2.4 统计学处理：实验数据用均数±标准差(±s)表示，SPSS 16.0统计软件进行统计学分析，采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 组织病理学表现(HE染色) 假手术组未发现明显的病理变化;单纯缺血组可见神经元大量变性、坏死，胞体呈三角形，胞浆致密，周围出现空晕，白质内出现散在的神经纤维及髓鞘溃变，表明脑组织有明显的缺血及脑白质受损表现;EGb761组神经元变性坏死及脑白质受损均较单纯缺血组减轻。
2.2 大鼠脑胶质细胞CNPase及GFAP的变化情况
2.2.1 CNPase变化情况：各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计CNPase阳性细胞个数。单纯缺血组CNPase阳性细胞数明显少于假手术组和EGb761组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。表1 大鼠皮层、胼胝体、海马CNPase阳性细胞表达情况 注：单纯缺血组与假手术组比较，*P<0.01;单纯缺血组与干预组比较，◆P<0.01
2.2.2 GFAP变化情况：各组均取皮层、胼胝体、海马处进行观察并统计GFAP阳性细胞数。单纯缺血组GFAP阳性细胞数明显多于假手术组和EGb761组，差异均具有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。表2 大鼠皮层、胼胝体、海马GFAP阳性细胞表达情况注： 干预组与单纯缺血组比较，◆P<0.01;单纯缺血组与假手术组比较，*P<0.01
3 讨论
少突胶质细胞(oligodendrocyte，OLG)是中枢神经系统的髓鞘形成细胞，在发生缺血缺氧性损伤后对神经系统正常功能的发挥产生严重的影响。而星形胶质细胞是中枢神经系统内在数目占绝对优势的一类胶质细胞, 被认为在神经元的整个发育过程中起重要作用[2]，它参与中枢神经系统内神经元功能的调节，在维持神经元的生存微环境中起着重要的作用。缺血性脑损伤后星形胶质细胞增生并产生许多生物活性物质， 对缺血损伤神经元具有保护作用;而过度增生可作为机械屏障影响髓鞘和轴索的再生，从而影响周围神经组织的结构修复和功能恢复。国际标准EGb761，含24%的银杏黄酮苷和6%的萜烯内酯等多种活性物质，现已证实，EGb中银杏黄酮为自由基清除剂， 银杏内酯为特异性PAF 受体阻滞药，对缺血时的神经元有保护作用。