高血糖对脑出血大鼠细胞凋亡及Bax表达的影响
作者：范顺太 李 平 王金兰 娄季宇 白宏英 陈江波
【摘要】 目的 探讨高血糖对大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax表达的影响。方法 采用立体定向技术制作大鼠脑出血模型。96只雄性SD大鼠被随机分为4组：假手术组、正常血糖组、高血糖组及胰岛素干预组，各组分别于术后6 h、24 h、3 d、7 d 4个时间点取脑组织，应用免疫组化方法检测血肿周围组织Bax的表达情况，TUNEL法检测血肿周围神经细胞凋亡。结果 高血糖组大鼠脑血肿周围组织Bax的表达及细胞凋亡明显高于其他组(P<0.01)，胰岛素干预组上述指标均低于高血糖组(P<0.01)，而高于假手术组，与脑出血组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 高血糖能增加大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax的表达，降糖治疗对脑神经细胞凋亡起保护作用。
【关键词】 脑出血;Bax;高血糖;细胞凋亡;胰岛素
【Abstract】 Objective To explore the effect of hyperglycemia on levels of neuron apoptosis and Bax in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage(ICH) in rats and their potential mechanism，so to provide the strategies for clinical treatment on cerebral hemorrhage.Methods ICH models were made by stereotactic technique, hyperglycemia models were induced in rats with injection of streptozotocin(STZ), 96 male SD rats were randomly divided into four groups: sham operation group, normal plasma glucose group, hyperglycemia and insulin intervention groups. Each group was divided into 4 various stages: 6h, 24h, 3d, 7d, protein expression of Bax in the perihematoma areas was detected by immunohistochemistry method. Apoptosis was characterized by terminal deoxyncleotide transferase mediated uridine 5triphosphatebiotin nick endlabeling(TUNEL)staining.Results Protein expression of Bax and neuron apoptosis of hyperglycemia group was higher than those of the other groups(P<0.01)，the abovementioned indices of insulin intervention group were lower than those of hyperglycemia group and higher than those of sham operation group(P<0.01),and insulin intervention group were even similar with those in the normal glucose group(P>0.05). Conclusion Hyperglycemia could increase the apoptotic neurons and stimulate the expression of Bax in perifocal tissue of intracerebral hemorrhage in rats.
【Key words】 Intracerebral hemorrhage; Bax; Hyperglycemia; Neuron apoptosis; Insulin
脑出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是指原发性非外伤性脑实质内出血，占急性脑血管病的20%～30%，发病率为(60～80)人/(10万·年)，急性期病死率30%～40%。已有多项研究证实细胞凋亡是脑出血的继发性损伤机制之一。糖尿病是最严重的全球性问题之一，糖尿病能增加脑出血患者早期的死亡风险[1],同时也是其预后不良的因素[2]。本实验通过建立高血糖脑出血模型，采用免疫组化和TUNEL法研究高血糖对大鼠脑血肿周围组织神经细胞凋亡和Bax的表达的影响，为高血糖脑出血的治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组 成年雄性SD大鼠96只，体质量200～250 g,由郑州大学实验动物中心提供。按照随机化原则将实验动物分为4组：假手术组、正常血糖组、高血糖组以及胰岛素干预组。每组设4个时间点：6 h、24 h、72 h、7 d，每个时间点设6只大鼠。
1.2 主要仪器及试剂 江湾Ⅱ型立体定位仪、微量进样器、显微外科手术器械、牙科钻、罗氏血糖仪(德国罗氏诊断有限公司)、兔抗大鼠Bax多克隆抗体、SP系列二抗、DBA显色液(均购北京中杉生物技术有限公司)、TUNEL试剂盒(Sigema公司);Streptozotocin(STZ)(Sigema公司);普通胰岛素，每瓶400U(10ml)(江苏万邦生化医药股份有限公司)。
1.3 高血糖模型大鼠的建立 参照STZ诱导法制备高血糖大鼠模型[1]，以STZ 60 mg/kg，对高血糖及胰岛素干预组大鼠单次腹腔注射，注射后1周检测血糖≥11.1 mmol/L为成功模型。
1.4 大鼠尾状核脑出血模型、高血糖模型的建立 高血糖模型[3]成功后，胰岛素干预组腹壁皮下注射普通胰岛素，3次/d,4 U/次，将血糖控制在8.3 mmol/L以下，直至实验结束。注射参照Xue等[4]的方法，大鼠用10%的水合氯醛(300 mg/kg)腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定向仪，行顶部正中切口，调整立体定向仪使大鼠前囟和后囟在同一水平面，于前囟前0.2 mm，中线向右旁开3.0 mm处进针，深度5 mm，即尾状核位置。假手术组缓慢注入50 μl灭菌生理盐水，其余各组缓慢注入50 μl自体动脉血，动脉血采自股动脉，15 min注射完毕，留针10 min后缓慢缓慢退出，缝合皮肤。
1.5 标本及病理切片的制作 将各组大鼠在相应的时间点用过量的水合氯醛麻醉，迅速打开胸腔，经左心室插管，同时剪开右心耳，快速灌注灭菌生理盐水，直至由右心耳流出的液体变为清亮为止，继而灌注4%的多聚甲醛液200 ml，然后断头取脑，脑组织标本浸入4%的多聚甲醛液后固定48 h，以注射点为中心取厚约1 cm的冠状切片，石蜡包埋。冠状位上连续切片，片厚4 μm，分别行免疫组化和TUNEL染色。
1.6 图像采集分析 光学显微镜下，DBA染色阳性细胞染色呈棕黄色，利用德国Leica显微成像系统和上海山富科学有限公司Biosens Digital Imaging System图像分析软件，计算每组大鼠血肿周围Bax阳性细胞的平均积分光密度。TUNEL结果计算：凋亡阳性细胞的细胞核呈棕黄色，细胞出现黄至棕黄褐色颗粒。在装有目镜网格测微尺的400倍视野下随机计数血肿周围4个视野内的阳性细胞数及神经细胞，计算凋亡指数(凋亡细胞数/神经细胞×100%)。
1.7 统计学分析 各组实验组数据均用均数±标准差(±s)表示，采用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，均数间的两两比较采用LSD检验，Bax与TUNEL的相关性采用直线相关分析，检验水准α=0.05。