菊花叶中总黄酮提取及对自由基清除作用的研究
3 结果与讨论
3.1 菊花叶总黄酮提取工艺的优化影响菊花叶总黄酮提取的主要因素有提取剂乙醇浓度、样品质量与乙醇体积比(料液比)、浸提温度和反应时间等，本实验采用表2所示的正交实验因素水平表，通过正交筛选法选出最佳的实验条件，实验结果如表3所示。
上述实验所用正交表除各因子外，由于无空白列做对照，所以采用常规方法，由正交表中极差项可知因素B和因素D的R值非常接近，因此将均方中B和D项均近似作为误差项，但在实际中以B项来计算各因素的F值和P值进行显著性判断。从表4方差分析结果表明，在95%置信水平下，从菊花叶提取总黄酮的工艺参数中，A因素和C因素影响高度显著，B和D因素影响可忽略。综合极差分析和方差分析可知上述4种影响因素的主次顺序为：A>C>B>D。菊花叶总黄酮提取的最佳浸提条件是A3B2C1D2，即以40%乙醇为提取溶剂，采用料液比1∶20(m∶V)，在60 ℃下提取2.5 h，测定吸光度，得到菊花叶总黄酮单位浸出量为72.485 4 mg/g。表1 ·OH实验加样表表2 正交因素水平表表3 L9(34)正交实验与结果表4 方差分析表
3.2 菊花叶总黄酮的提纯
3.2.1 菊花叶总黄酮的萃取提纯分别使用醋酸乙酯、氯仿和氯仿-醋酸乙酯(1∶1)3种溶剂系统对菊花叶总黄酮水溶液进行连续萃取，以3次累积萃取率为指标确定最佳萃取溶剂系统。实验结果如表5所示，从表中可以看出3种溶剂系统的菊花叶总黄酮的累积萃取率都不高，可能的原因是菊花叶中黄酮类物质的极性比较大，而实验所用的3种溶剂系统中只有醋酸乙酯极性中等，其他溶剂系统极性比较小，由相似相溶原理可知菊花叶总黄酮在这些溶剂系统中的溶解性较差。由实验结果可知，采用醋酸乙酯作为萃取溶剂时，菊花叶总黄酮的累积萃取率最高可达17.26%。
3.2.2 菊花叶总黄酮的柱色谱提纯大孔吸附树脂预处理：取适量D-101大孔吸附树脂用3 BV无水乙醇浸泡24 h，倾倒上层乙醇，然后装入玻璃层析柱，用无水乙醇以2B V/h的流速通过树脂层，至流出液加去离子水不呈浑浊为止，并用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液没有醇味为止;然后用2 BV 5%稀盐酸溶液以2 ml/ min 流速通过树脂层，并浸泡1 h后用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液pH值为中性;最后用2 BV 4%氢氧化钠溶液以2 ml/min 流速通过树脂层，并浸泡1 h后用去离子水以相同的流速冲洗树脂层至流出液pH值为中性。表5 不同萃取系统对菊花叶黄酮水溶液的累积萃取效果 将“3.2.1”节中醋酸乙酯总黄酮萃取液4.00 ml(经测定，总黄酮浓度为202.8 μg/ml)拌适量预处理过的大孔吸附树脂，挥干再采用湿法装柱干法上样。以洗脱液体积(BV)为横坐标，单位洗脱量(μg/BV)和累积洗脱量(μg)，做室温下70%乙醇分离提纯总黄酮的洗脱曲线如图2所示。图2 菊花叶总黄酮的洗脱曲线由单位洗脱量曲线可以看出，当洗脱液体积<1 BV时，随着洗脱液的增加，单位洗脱量也随之增加;当洗脱液为1 BV时出现了明显的洗脱峰;当洗脱液体积>1 BV时，单位洗脱量随着洗脱液的增加而递减;而当洗脱体积为3.5 BV时总黄酮基本被洗脱下来。由累积洗脱量曲线可以看出，当洗脱液体积<1.5BV时，随着洗脱液的增加，累积洗脱量增加明显;当洗脱液体积>1.5 BV时，随着洗脱液增加，累积洗脱量增加缓慢;当洗脱液体积为3.5 BV时几乎达到洗脱极限，此时总黄酮的累积洗脱率为102.2%。
3.3 清除羟自由基研究结果将“3.2.2”节中经D-101大孔吸附树脂分离富集的菊花叶总黄酮提取液进行清除羟自由基研究，实验结果见下图3所示。从图3中可以看出，菊花叶总黄酮提取液对由Fenton 体系产生的·OH 有一定的清除作用，随着溶液中总黄酮含量的增加，总黄酮对·OH 的清除能力也逐渐增强。当样品溶液中总黄酮浓度<14.80 μg/ml时，随着浓度的增加，清除率增加明显;当总黄酮浓度在14.80～29.59 μg/ml之间时，随着浓度的增加，清除率增加缓慢;当总黄酮浓度在29.59～34.53 μg/ml之间时，随着浓度的增加，清除率保持在较高的水平不变，此时清除率高达92.50%。图3 羟自由基的清除作用
4 结论
本实验通过正交实验的研究，确定了菊花叶中总黄酮的的最优提取工艺条件，实验结果表明菊花叶中总黄酮的最佳提取工艺：即以40%乙醇为提取溶剂，采用料液比1∶20(m∶V)，在60 ℃下提取2.5 h。此法方法简便、快速，适用于规模化的生产。实验考察了多种不同溶剂系统对菊花叶总黄酮水溶液进行萃取测定，结果表明使用醋酸乙酯溶剂系统萃取3次，总黄酮的萃取率可达17.26%，使用D101大孔吸附树脂对醋酸乙酯总黄酮萃取液进行分离提纯，实验中出现了明显的洗脱峰，当洗脱体积为3.5 BV时黄酮类物质基本被洗脱下来，此时洗脱率为102.2%。此外还探讨了菊花叶中总黄酮对Fenton体系产生的·OH有较好的清除作用，为证明菊花叶的药用价值提供了科学依据。
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