端粒、端粒酶与肿瘤
端粒(即染色体末端)的发现已有很长的，但对其结构、功能、合成及其重要意义的认识，近年来有了很大进展。本文就端粒、端粒酶的研究进展以及他们与肿瘤的关系综述如下。
一、端粒
(一)端粒的结构
端粒是位于染色体3′末端的一段富含G的DNA重复序列，端粒和端粒结合蛋白组成核蛋白复合物，广泛存在于真核生物细胞中，具有特殊的功能。不同种类细胞的端粒重复单位不同，大多数长5～8bp，由这些重复单位组成的端粒，突出于其互补链12～16个核苷酸内［1］。人类端粒由5′TTAGGG3′的重复单位构成，长度在5～15kb范围［1，2］。与端粒特异性结合的是端粒结合蛋白，迄今为止，只在少数生物中确定了端粒结合蛋白的结构及表达基因，然而端粒结构与功能的保守性表明，这些端粒结合蛋白的特性可能普遍适用于其他真核生物。Chong等［3］在人类细胞中发现了一种端粒结合蛋白，但人类染色体末端的DNA-蛋白复合体的结构还不清楚。
(二)端粒的功能
端粒高度的保守性表明，端粒具有非常重要的作用。其主要功能包括：
1.保护染色体末端：真核生物的端粒DNA-蛋白复合物，如帽子一般，保护染色体末端免于被化学修饰或被核酶降解，同时可能还有防止端粒酶对端粒进行进一步延伸的作用［1］。改变端粒酶的模板序列将导致端粒的改变，从而诱导细胞衰老和死亡［4］。
2.防止染色体复制时末端丢失：细胞分裂、染色体进行半保留复制时，存在染色体末端丢失的问题［5］。随着细胞的不断分裂，DNA丢失过多，将导致染色体断端彼此发生融合，形成双中心染色体、环状染色体或其他不稳定形式。端粒的存在可以起到缓冲保护的作用，从而防止染色体在复制过程中发生丢失或形成不稳定结构［1］。
3.决定细胞的寿命：染色体复制的上述特点决定了细胞分裂的次数是有限的，端粒的长度决定了细胞的寿命，故而被称为“生命的时钟”［6］。
4.固定染色体位置：染色体的末端位于细胞核边缘，人类端粒DNA和核基质中的蛋白相互作用，以′TTAGGG′结构附着于细胞核基质(包括nuclear envelope和internal protein)［3］。
(三)端粒的长度
端粒的长度在不同的细胞之间存在着差异。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度大于体细胞［7］。体外培养细胞端粒的长度随着细胞逐代相传而缩短，每复制一代即有50～200nt的DNA丢失，端粒丢失到一定程度即失去对染色体的保护作用，细胞随之发生衰老和死亡。所以，通过测定端粒的长度可以预测细胞的寿命［6］。人体细胞端粒的长度不一，存在着个体差异，随着年龄的增长，端粒每年减少约15～40 nt［7］，最终细胞衰老。胚胎细胞和生殖细胞端粒的长度不随着细胞分裂次数的增加而缩短，具有无限分裂的能力，其原因就在于端粒酶的存在［7］。
二、端粒酶
(一)端粒酶的结构和功能
端粒酶是由端粒酶RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶，通过识别并结合于富含G的端粒末端，以自身为模板，逆转录合成端粒［1］。
1995年，Junli等［8］克隆了人类端粒酶RNA基因，在长约450个碱基的人端粒酶RNA(hTR)序列中，有一段长11个核苷酸的区域(5′-CUAACCCUAAC-3′)，与人端粒序列(TTAGGG)n互补，发生在该模板区域的hTR突变将导致端粒酶功能的改变。
端粒酶蛋白质成分的分离十分困难，直到1995年，Greider等［9］才纯化并克隆了四膜虫端粒酶的两个多肽成分，即p80和p95。1997年，人们克隆并描述了两种人类端粒酶蛋白TP 1(telomerase associated protein 1)［10］和TP 2(telomerase associated protein 2或hTRT)［1 1］。其中TP 1与四膜虫端粒酶蛋白p80同源，能与端粒酶RNA特异性结合；TP 2与啤酒酵母S.cerevisiae的端粒酶蛋白Est2p同源，和逆转录酶的结构相似，是端粒酶的催化亚单位，在肿瘤细胞端粒酶的激活中起关键作用［12］。
四膜虫端粒酶RNA及其两个多肽成分(p80, p95)是组成端粒酶的唯一必要成分，鉴于端粒酶在进化中的保守性，hTR和TP 1、TP 2是否构成了完整的人类端粒酶，目前尚无定论。
(二)端粒酶活性的调节
端粒酶的活性在不同的层次上受到各种因素的调节。
1.hTR: hTR是端粒酶的重要成分，在体外培养的HeLa细胞中转染反义端粒酶RNA，将导致端粒DNA的缩短和肿瘤细胞的死亡［8］。但许多研究表明，hTR的水平并不能代表端粒酶活性水平，缺乏端粒酶活性的细胞同样可以有hTR的表达。可见端粒酶RNA并不是调节端粒酶活性的唯一因素［13］。
2.端粒酶蛋白：TP 1或TP 2基因的突变，均可导致端粒酶的失活［10，11］，TP 2基因在不同的细胞有不同的剪切位点，可能以此改变TP 2的生化特性，从而起重要的调节作用［14］。
3.癌基因与抑癌基因：癌基因和抑癌基因对肿瘤的发生、起着重要的作用。Wright等［15］根据体外培养细胞的永生化过程提出了肿瘤发生的M1/M2模型，即细胞经过有限次的分裂后进入M1期，细胞衰老走向死亡，抑癌基因p53或Rb的突变等使细胞逃脱生长控制的机理使细胞渡过M1期，再次经过若干次的分裂，进入M2期，少数细胞发生端粒酶的激活成为永生细胞，此时仍然需要p53或Rb的突变存在。有研究报道，使缺乏抑癌基因p53/Rb的肿瘤表达Rb蛋白(pRb)，细胞停滞在G0/G1期并发生老化现象，抑制pRb后细胞重新开始合成DNA，但大多数细胞在分裂中死亡，p53无此现象［16］。另一项关于卵巢癌的研究提示，p53与端粒酶活性无关［17］。抑癌基因与端粒酶的关系并不明确。
4.细胞分化及细胞周期对端粒酶活性的影响：用药物诱导的细胞分化实验表明，随着细胞分化，端粒酶活性随之降低，而抗分化的细胞则无影响［18］，永生细胞株端粒酶的活性在各细胞周期中无显著变化，而与细胞的生长速度相关［19］，使细胞脱离生长周期能否抑制端粒酶的活性，各报道不一［18，19］。然而，作出端粒酶活性与细胞周期无关的结论为时尚早，细胞的生长、分化与端粒酶活性调节间的关系，还有待于研究。
5.端粒的长度与端粒酶激活：当端粒缩短到一定程度后才有端粒酶的激活，其机理可能在于，缩短的端粒导致基因的不稳定，某些突变如激活端粒酶、丢失抑癌基因使细胞获得不死性，成为优势克隆。端粒的缩短成为端粒酶激活的前提［20］。但此理论不能解释某些肿瘤细胞中端粒较长的现象。
端粒酶活性的调节机理错综复杂、说法不一，胚胎早期端粒酶的活性随着胚胎的发育而逐渐消失(生殖细胞例外)，而细胞获得不死性及肿瘤的发生，又与端粒酶的再次激活密切相关，其机理目前还不清楚。
三、端粒、端粒酶与肿瘤
(一)端粒、端粒酶与人类肿瘤的关系
正常细胞的分裂次数是有限的。端粒酶的激活是细胞走向永生化的必要途径，而永生化又被认为是肿瘤恶化的必要步骤。肿瘤细胞的端粒长度很短，其继续缩短将导致染色体融合、细胞死亡，而端粒酶的激活可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生存［21］。端粒酶的表达，可能是肿瘤形成和发展的共同途径。
人类细胞端粒酶活性水平较低，以及很难获得大量的肿瘤标本，使得早期对人类端粒酶的研究受到了很大限制。1994年，Kim等［22］创立了测定端粒酶活性的telomere repeat amplification protocol(TRAP)法，用裂解缓冲液代替原低渗液，提高了细胞的裂解程度，并引入聚合酶链反应(PCR)，使反应的灵敏性提高了104倍。至今已在大多数人类恶性肿瘤中测到了端粒 酶的活性。有些实验表明，端粒酶的活性与某些肿瘤的恶性程度和预后相关［17，21］。端粒酶在恶性肿瘤发展中的作用日益明晰［21］。
(二)端粒酶在妇科肿瘤方面的研究
大多数妇科恶性肿瘤有端粒酶的表达［23］。由于卵巢含生殖细胞成分，子宫内膜周期性脱落具有再生能力，使得端粒酶具有不同于一般组织的特殊性。
1.卵巢肿瘤：良性卵巢肿瘤(如生殖细胞肿瘤、乳头状囊腺瘤)、交界性肿瘤及绝经前正常卵巢可测出端粒酶活性。但在恶性卵巢癌、低分化卵巢肿瘤及有淋巴转移者，端粒酶活性显著增高。初步的研究表明，端粒酶活性与上皮性卵巢癌的发展及蔓延相关［17，24］。腹水细胞的结果并不一致，有报道认为，端粒酶的阳性率不高［23］。
2.子宫内膜癌：端粒酶在子宫内膜癌中表现为强阳性，同时正常子宫内膜可以有端粒酶活性，绝经前甚至可表现为强阳性。有关研究未发现端粒酶活性与肿瘤的分期、浸润的深度及DNA的成分相关［25］。这与子宫内膜的周期性再生有关。
3.宫颈癌：有研究表明，端粒酶的激活发生在宫颈癌的早期，与其进展有关，有希望成为宫颈癌诊断及预后的标记物［26］。虽然绝大多数宫颈癌端粒酶阳性，但在正常宫颈及宫颈上皮内瘤样变中的阳性率报道不一。Zheng等［26］的研究结果为，宫颈脱落细胞涂片的端粒酶阳性率分别为7%及40%，而Gorham等［23］报道的阳性率为0%。
(三)临床应用前景
1.肿瘤的方面：端粒酶与恶性肿瘤之间令人惊异的相关性，使他在肿瘤的诊断和治疗上有望成为行之有效的新的靶目标。因为端粒酶主要存在于恶性肿瘤，而在大多数正常组织中没有活性或活性极低，同时由于端粒酶在恶性肿瘤的发生，尤其是在肿瘤的发展中起着关键的作用［21］。所以，通过各种途径抑制端粒酶的活性，可能将有效地抑制大多数肿瘤的生长，而对大多数正常细胞没有影响。这种抑制作用可以通过直接抑制端粒酶活性、抑制端粒酶RNA(如导入反义核酸)，或端粒酶蛋白成分以及诱导肿瘤细胞发生分化等方法实现。
2.诊断与鉴别诊断及临床预后方面：端粒酶可以出现在某些肿瘤的早期甚至癌前病变，在分化低有转移倾向的肿瘤中高度表达，使其在诊断及评价预后方面，具有一定价值。
在人类端粒及端粒酶的基础研究中，还存在着许多问题，有待进一步研究，如人类端粒末端的精细结构，端粒的非端粒酶延伸机理；人类端粒酶的具体结构及其基因所在的位置；端粒酶的激活机理及其活性调节；端粒酶在肿瘤的发生中的作用；如何有效地抑制端粒酶活性；缺乏端粒酶活性的肿瘤的生长机理等。总之，端粒、端粒酶在肿瘤的研究中具有广阔的前景，将为人类攻克肿瘤开辟新的视野。
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