谷胱甘肽S?转移酶A1在肝癌中的异常表达

              作者：韦薇，李瑗，苏建家，曹骥，欧超，杨春，班克臣，岳惠芬

【摘要】  　　目的 探讨GSTA1基因在肝癌形成中的作用。方法 应用RT?PCR方法检测35例AFB1诱发的树鼩肝癌、癌旁和癌前组织，以及35例人肝癌和癌组织中的GSTA1 mRNA表达情况；应用免疫组化方法检测以上组织的GSTA1蛋白表达情况。结果 树鼩肝癌组织的GSTA1 mRNA和蛋白表达水平均低于癌旁及癌前组织；人肝癌组织的GSTA1 mRNA表达水平、蛋白阳性表达率和表达综合得分均显著低于癌旁组织(分别为P＜0.001、P＜0.05和P＜0.001)。结论 GSTA1可能是肝癌发生的重要相关基因之一；在mRNA水平和蛋白质水平动态观察相关基因在肝癌形成过程中的表达变化有助于阐释肝癌发生的分子机制。

【关键词】  肝癌　谷胱甘肽S?转移酶A1；树鼩

　　Abnormal Expression of GSTA1 in Hepatocellular Carcinoma

        Key words：Hepatocellular carcinoma; Glutathione S?transferase A1; Tree shrew

　 我们在用cDNA芯片筛选肝癌相关基因的前期工作中，发现编码α类谷胱甘肽S?转移酶（GSTs）基因的家族成员之一—谷胱甘肽S?转移酶A1（GSTA1）的表达水平在AFB1诱发的树鼩肝癌形成过程中下调[1]。近年来研究表明，GSTs对肝脏疾病尤其是肝癌的发生、发展及转归有着重要意义，但目前国内外对GSTA1的研究报道尚少。本研究通过检测GSTA1 mRNA和蛋白在AFB1诱发的树鼩肝癌形成过程中的表达变化情况，并在人肝癌组织中进行验证，探讨GSTA1在肝癌形成中的作用及其机制。

    1  材料与方法

    1.1  标本来源

    1.1.1  动物实验及肝组织标本的获取  购自中科院昆明生物研究所的成年雄、雌性树鼩随机分为实验组和对照组：实验组（54只）自第1周至第90周喂予AFB1（美国Sigma公司产品）；对照组（12只）按正常饲养方法喂养。实验结束于第165周，实验期间定期对所有动物进行剖腹手术取肝组织活检；动物发生肝癌处死后，取出肝癌和癌旁组织。

    1.1.2  人肝组织标本  35例人肝癌组织及相应的癌旁肝组织（距离肿瘤边缘2cm以外）取自广西医科大学附属肿瘤1999～2002年肝胆外科手术切除标本。其中男性32例，女性3例；年龄25～70岁，中位年龄47岁。

    上述标本均取一部分经液氮速冻后保存于-80℃冰箱待用，其余固定于10%中性福尔马林。

    1.2  主要方法

    1.2.1  逆转录多聚酶链反应（RT?PCR）及测序  用Trizol试剂（美国Invitrogen公司产品）经一步法提取组织总RNA，再经RT?PCR合成cDNA。以看家基因GAPDH作为内参照。引物由上海生工生物公司合成，各基因的上、下游引物序列如下：

    GSTA1：5’TTC AAT GCA CGG GGC AGA AT3’和5’TCA ATC AGG GCT CTC TCC TT3’；扩增片段长度为251bp。

    GAPDH：5’TCA TTG ACC TCA ACT ACA TG3’和5’GCA GTG ATG GCA TGG ACT GT3’；扩增片段长度为437bp。

    引物先稀释为10pmol/L，再按25ul反应体系进行PCR扩增。反应条件：94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min，30个循环；72℃ 10min。PCR产物于1.7%琼脂糖凝胶电泳后置于凝胶成像分析系统（美国Bio?Rad公司产品）进行半定量分析。用目的基因和看家基因两电泳条带单位面积内的灰度比值来反映目的基因的相对表达水平。PCR产物的纯化及测序由上海基康生物技术有限公司完成。

    1.2.2  免疫组织化学染色  即用型SP试剂盒、内源性生物素阻断试剂盒均为福州迈新生物技术公司产品；兔抗人、兔、大鼠、小鼠的GSTA1多克隆抗体为美国NeoMarkers公司产品。检测树鼩肝组织的工作浓度为1∶50，人肝组织的工作浓度为1∶150。免疫组化染色程序按试剂盒说明书进行。用PBS代替一抗作阴性对照；人的正常肝组织作阳性对照片。

    细胞浆和/或细胞核呈黄色或棕黄色判为GSTA1阳性细胞；阳性细胞率＜5%为阴性表达。将每张切片上阳性细胞的染色强度分为1（±）、2（+）、3（++）和4（+++）级；阳性细胞的百分率分为 I（5%～25%）、II（26%～50%）、III（51%～75%）和IV（＞75%）级。用染色强度级别与阳性细胞的百分率级别的乘积—“免疫组化染色综合得分”来反映该蛋白的表达水平[2]。

    1.3  统计学处理  计量资料采用配对t检验、单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。

    2  结果

    2.1  树鼩肝癌发生情况

    至实验第165周，实验组54只树鼩共有35只发生肝癌，发生率为64.8%。肝癌发生的时间最早为实验第88周，最晚为165周，平均时间为122周±23周；对照组12只树鼩无一发生肝癌。所有树鼩和人肝癌标本均经组织病证实。树鼩肝癌的病理组织学改变，见图1。

    本研究选取实验组最终发生肝癌的动物在肝癌发生前的活检肝组织，即实验第45周的肝活检组织作为“癌前”组织；选取正常对照组的第45周和第120周活检肝组织分别作为癌前和肝癌组织的“正常同期对照”。

    2.2  GSTA1 mRNA在树鼩肝癌和人肝癌组织中的表达

    经RT?PCR扩增，受测的树鼩和人肝组织标本均有目的基因GSTA1及看家基因GAPDH表达，见图2。应用BlASTN软件对所扩增的树鼩GSTA1的DNA片段序列进行同源性分析，结果显示树鼩该基因与人类相应基因的同源性为90%。

    35例树鼩肝癌组织的GSTA1 mRNA表达水平明显低于相应癌旁及癌前组织（分别为P=0.013、P=0.003）；35例人肝癌组织中的GSTA1 mRNA表达水平也明显低于癌旁组织（P＜0.001），见表1。表1  GSTA1 mRNA在树鼩和人肝组织中的表达变化

    2.3  GSTA1 蛋白在树鼩肝癌和人肝癌组织中的表达

    GSTA1 蛋白分布于肝细胞浆和(或)胞核内，见图3、4。35例树鼩肝癌组织的GSTA1蛋白表达综合得分低于癌旁、癌前和正常对照动物的同期活检肝组织，其中与癌前组织的差别具有统计学显著性（P=0.015）；而癌前组织中该蛋白的表达水平明显高于正常对照动物的同期活检肝组织（P＜0.001）。在35例人肝癌组织中GSTA1蛋白阳性表达29例（82.86%），癌旁组织全部阳性表达（100%），两者差别显著(P=0.011)；人肝癌组织中的GSTA1蛋白表达水平的综合得分也明显低于癌旁组织(P＜0.001)，见表2。 表2  GSTA1蛋白在树鼩各期肝组织和人肝癌、 癌旁组织中的表达综合得分

    3  讨论

    黄曲霉毒素B1(AFB1)是已经明确的肝癌的重要致病因素之一[3]，它可以引发急性毒性反应致肝细胞死亡，也可以引起DNA突变、癌基因激活而最终导致肝癌发生。

    谷胱甘肽S?转移酶（GSTs）是一组广泛存在于生物界并参与体内生物转化Ⅱ相结合反应的同功酶系，主要功能是催化还原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）与亲底物结合或以非酶结合方式将体内各种潜在毒性的化学物质、染料、致癌物及亲脂性化合物从体内排出，以达到解毒的目的。研究发现小鼠体内低水平的GSTs和高水平的AFB1?DNA加合物与肝细胞增生、肝癌形成有密切关系[4]。已知GSTs是由23?29Kda的不同亚基构成的二聚体，每一类GSTs同工酶中组成的亚基种类很多，因此编码GSTs同工酶的基因是一个巨大的超基因家族，目前的研究发现GSTs至少分为包括α?GST、μ?GST、π?GST在内的七大类[5]。

    GSTA1为编码α?GSTs的基因之一，在正常肝脏和肾脏组织中高表达。由GSTA1编码的同源二聚体蛋白—GSTA1?1在人类血浆和肝组织中的含量约占总α?GSTs含量的一半。目前关于GSTs在肝癌方面的报道主要集中在μ?GST、π?GST多态性与肝癌易感性的关系等方面[6]，而关于α?GSTs 尤其是GSTA1在肝癌中的表达等相关报道甚少。GSTs与肝癌发生的关系及作用至今尚未得以阐明。

    Rozen等[7]的体外实验表明，在HepG2细胞株中GSTA1 mRNA表达水平明显低于人正常肝细胞。本实验发现，GSTA1 mRNA在AFB1诱发的树鼩肝癌组织中与相应癌旁及癌前组织相比表达下调。GSTA1蛋白在树鼩肝癌中表达综合得分低于癌旁、癌前及正常对照动物的同期活检肝组织。癌前组织中该蛋白水平明显高于正常对照动物的同期活检肝组织和肝癌组织，这可能由于树鼩受到一定时间AFB1作用后，肝细胞内GSTA1水平反应性增高以清除AFB1而致。但由于长期大量的AFB1刺激，肝细胞受损甚至恶变，无法正常生成GSTA1，故在肝癌组织中表达下降。此外，本实验人肝癌中GSTA1 mRNA和蛋白的表达情况与树鼩肝癌的表达情况相似，均明显低于相应的癌旁组织，且蛋白阳性表达率也明显低于癌旁组织。这些结果提示在肝癌形成早期阶段GSTA1可能因为致癌因子的作用而表达上调，但随着肝细胞的损伤和恶变，GSTA1表达水平逐渐下降甚至表达缺失。因此推测GSTA1在肝脏中的表达变化可能主要与化学致癌因子（如AFB1）刺激肝细胞的时间、强度及引起相应肝细胞的损伤程度有关，并由此影响肝癌的发生和发展。本研究结果还表明，在mRNA水平和蛋白质水平动态观察相关基因在肝癌形成过程中的表达变化有助于了解肝癌发生发展的分子机制。

【】
  　　［1］ Li Y, Wan DF, Su JJ, et al. Differential expression of genes during aflatoxin B1?induced hepatocarcinogenesis in tree shrews [J]. World J Gastroenterol, 2004, 10(4): 497?504.

[2]Sinicrope FA, Ruan SB, Cleary KR, et al.Bcl?2 and p53 oncoproteins expression during colorectal tumorigenesis [J]. Cancer Res, 1995, 55(2): 237?241.

[3]McGlymm KA, Hunter K, LeVoger T, et al. Susceptibility to aflatoxin B1?related primary hepatocellular carcinoma in mice and humans [J]. Cancer Res, 2003, 63(15): 4594?4601.

[4]Shupe T, Sell S. Low hepatic glutathione S?transferase and increased hepatic DNA adduction contribute to increased tumorigenicity of aflatoxin B1 in newborn and partially hepatectomized mice [J]. Toxicol Lett, 2004, 148(1?2): 1?9.

[5]Whale R, Boyer T. Human glutathione S?transferase [J]. Semin Liver Dis, 1998, 18(4): 345?358.

[6]Sun CA, Wang LY, Chen CJ, et al. Genetic polymorphisms of glutathione S?transferases M1 and T1 associated with susceptibility to aflatoxin?related hepatocarcinogenesis among chronic hepatitis B carriers: a nested case?control study in Taiwan. [J]. Carcinognesis, 2001, 22(8): 1289?1294.

[7]Rozen F, Nguyen T, Pickett CB. Isolation and characterization of a human glutathione S?transferase Ha1 subunit gene [J]. Arch Biochem Biophys, 1992, 292(2): 589?593.