抗肝癌hdsFv融合RC?RNase重组免疫毒素的表达、纯化及活性测定

                  作者：付勇 苏雪梅, 刘彦仿, 杨守京, 赵君, 邹赛英

【摘要】  　　目的 制备有临床应用前景的特异性高、稳定性强的新型抗肝癌重组免疫毒素。方法 利用IPTG诱导抗肝癌hdsFv?RC?RNase重组免疫毒素在大肠杆菌中表达。表达产物经Ni?NTA亲合层析法纯化并复性，应用免疫细胞化学和MTT的方法分别检测其对人肝癌细胞的特异性结合和杀伤活性。结果 重组免疫毒素以可溶性形式在大肠杆菌中获得表达。免疫细胞化学和细胞毒实验表明其能够特异性地结合并杀伤肝癌细胞，并且能够保持较强的稳定性。结论 我们抗肝癌hdsFv?RC?RNase重组免疫毒素的成功制备，为其进一步的临床应用研究奠定了一定的实验基础。

【关键词】  肝细胞癌　免疫毒素　二硫键稳定单链抗体　牛蛙核糖核酸酶

　　Expression, purification and functional detection of anti?HCC hdsFv fused with RC?RNase

        Key words：Hepatocellular carcinoma(HCC); Immunotoxin; dsFv; RC?RNase

　肝细胞癌(Hepatocellular carcinom, HCC)其早期诊断和仍然是目前肝癌研究的热点。免疫毒素具有能够特异性杀伤肿瘤细胞的优点,在肿瘤导向治疗中显示出巨大的应用潜力。但是传统的免疫毒素分子量大,穿透力差,难以大规模制备,特别是对实体肿瘤的治疗很难达到如血液系统肿瘤的疗效。基因重组免疫毒素能够有效解决上述问题,并在体外及动物实验中取得了良好效果[1，2]。牛蛙核糖核酸酶(RC?RNase)分子量小,细胞毒性强,对肿瘤细胞具有强大的杀伤作用,可作为重组免疫毒素的弹头物质[3,4]。在本研究中,我们在大肠杆菌中表达并纯化了抗肝癌hdsFv?RC?RNase重组免疫毒素,并对其生物学活性进行了初步研究。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  质粒、菌株及细胞系

    抗肝癌hdsFv?RC?RNase原核表达载体pTIH?hdsFv?RC?RNase为作者构建。E.coli BL21（DE3）plyS和人肝细胞癌细胞系HepG2为本室保存。

    1.1.2  主要试剂

    IPTG低分子量标准蛋白购自华美生物工程公司。精氨酸、EDTA、还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、PMSF购自上海生工生物工程公司。 Ni?NTA Agarose亲合柱层析填料购自QIAGEN公司。RPMI1640固体培养基购自GIBCO公司。胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料研究所；鼠抗6×His抗血清购自第四军医大学免疫教研室。HRP标记的羊抗鼠IgG及DAB显色剂购自Dako公司。

    1.2  方法

    1.2.1  抗肝癌hdsFv?RC?RNase融合蛋白诱导表达及纯化

    将原核表达载体pTIH?hdsFv?RC?RNase转化到大肠杆菌 BL21（DE3）plyS中,涂板挑取单克隆37℃振荡培养过夜。取过夜菌以2%接种于培养液中，当A600达到0.5时，加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG30℃继续培养4h。离心集菌体，冰浴条件下超声碎菌，离心，取上清液按QIAGEN公司产品操作过程在非变性条件下进行Ni?NTA Agarose亲合层析法纯化。

    1.2.2  纯化产物的复性

    将抗肝癌hdsFv?RC?RNase纯化产物在复性液（0.1 mol/LTis?HCl pH8.0, 100 mmol/L EDTA,0.25  mol/L NaCl,0.5mol/L精氨酸，0.5%NP?40, 0.4mmol/L PMSF, 2mmol/L还原型谷胱甘肽，0.2 mmol/L氧化型谷胱甘肽）4℃透析24h后，然后经透析液（0.1mol/L Tis?HCl pH8.0,0.5mol/L NaCl，5%蔗糖）透析48 h，PEG?8000沉淀法浓缩，核酸蛋白检测仪定量，4℃储存备用。

    1.2.3  抗肝癌hdsFv?RC?RNase抗原结合活性检测

    将人肝癌细胞HepG2在含10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规传代培养，制备细胞爬片，用4℃甲醇：丙酮（1/1）固定液固定。细胞爬片经80%甲醇?H2O2(4ml甲醇+1ml蒸馏水+50 μl H2O2)阻断内源性过氧化物酶，以hdsFv?RC?RNase为一抗，鼠抗6×His抗血清为二抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为三抗，进行免疫细胞化学染色。以PBS为阴性对照，抗出血热病毒1A8单克隆抗体为无关抗体对照。

    1.2.4  抗肝癌hdsFv?RC?RNase的杀伤活性检测

    取人肝癌细胞HepG2 与正常肝细胞HL02按1×104/孔铺96孔板，100 μl/孔，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液37℃培养24h后弃去旧培养液，加入培养液作不同稀释的抗肝癌hdsFv?RC?RNase，于37℃孵育12h，洗涤3次后加入新培养液继续培养48h。每孔加5g/L噻唑蓝50μl于37℃作用4h。弃去反应混合物并加入150μl二甲基亚砜，振洗10min，在酶标仪上测定A495值。由A495值细胞杀伤率。计算公式为：细胞杀伤率（%）=（1?实验组A495/ 空白对照组A495）×100%。设立PBS为空白对照，hdsFv?E?tag为替代对照。

    1.2.5  抗肝癌hdsFv?RC?RNase稳定性的检测

    将纯化表达产物于4℃放置3个月后，按1.2.3和1.2.4的方法重复进行免疫细胞化学染色和杀伤活性检测，以测定长时间保存后表达产物活性的稳定性。

    2  结果

    2.1  抗肝癌hdsFv?RC?RNase融合蛋白的表达及纯化

    经0.1mmol/L IPTG在30℃诱导4h，抗肝癌hdsFv?RC?RNase融合蛋白以可溶性蛋白形式表达在细菌上清中。融合蛋白碳末端含有6×His标签蛋白，经Ni?NTA Agarose亲合层析法纯化后，蛋白纯度达到基本均一，见图1。

    1:Uninduced; 2:Low molecular protein marker;3: Total protein of induced;4:Supernatant of induced; 5:Precipitation of induced; 6:Purified product

    图1  抗肝癌hdsFv?RC?RNase的表达及

    纯化的SDS?PAGE分析

    2.2  抗肝癌hdsFv?RC?RNase抗原结合活性

    免疫细胞化学染色。结果显示，反应阳性的棕黄色颗粒特异性地定位于肝癌细胞的细胞膜上，少数存在于细胞浆中，见图2，这一结果与亲本抗体的实验结果相一致，而阴性对照及无关抗体对照结果均呈阴性，说明hdsFv?RC?RNase具有亲本抗体的特异性和亲和性。

    2.3  抗肝癌hdsFv?RC?RNase的杀伤活性

    MTT检测结果显示hdsFv?RC?RNase对肝癌细胞具有明确的杀伤活性，IC50为6.8μg/L，且随着免疫毒素浓度增加，杀伤率逐渐提高，而正常肝细胞HL02的生长则不受影响，初步说明hdsFv?RC?RNase对肝癌细胞具有一定的杀伤作用，见图3。

    2.4  抗肝癌hdsFv?RC?RNase的稳定性

    纯化的hdsFv?RC?RNase稳定性检测结果显示，hdsFv?RC?RNase仍能保持其生物学活性无明显下降，表明免疫毒素确实具有较强稳定性。

    图3  抗肝癌hdsFv?RC?RNase免疫毒素的杀伤活性检测

    3  讨论

    RC?RNase属于核糖核酸酶（Ribonuclease,RNase）超家族[5,6]。许多研究表明，RNase超家族不仅具有催化功能，而且具有细胞毒性，表现出强大的抗肿瘤作用。由于它们能够特异性杀灭恶性肿瘤细胞，因此有望成为一类新型的抗肿瘤药物[7,8]。细胞毒性RNase分子量小，且它们中的一些成员来自于人体，作为重组免疫毒素的弹头物质制备基因重组免疫毒素，不但可增强杀伤恶性肿瘤细胞的活性，而且与传统植物或细菌毒素免疫毒素相比，免疫源性低，穿透力强，在肿瘤导向中显示出巨大的应用前景。有人将RNase?A与表皮生长因子融合制备的重组免疫毒素，经体外细胞毒实验证实对表达表皮生长因子受体的肿瘤细胞具有特异性杀伤作用[9]。Deonarain等[10]研究表明制备BS?RNase单链重组免疫毒素不但可显著增强抗肿瘤效果，而且大大降低毒副作用。

    近二十年来，抗体的研究经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程抗体三个阶段的过程，其中基因工程抗体scFv具有分子量小，特异性强，亲和性高等优点是目前较为理想的免疫毒素的载体。通过二硫键稳定制备的dsFv比scFv稳定性强，表达产量高，在动物实验中dsFv免疫毒素表现出更好的抗肿瘤活性[11,12]。在多年研究中，我们先后制备了特异性强、亲和力高的抗肝癌单克隆抗体[13]，通过基因工程改造后获得的鼠scFv基本保持亲本抗体的特异性和亲和性，荷瘤裸鼠实验证明，鼠scFv免疫毒素对肝癌具有明确的导向治疗作用[14]。为了降低免疫源性和增强稳定性，经人源化和二硫键稳定制备了hdsFv，4℃放置3个月活性基本保持不变[15]。在过去研究基础上，我们构建并表达了抗肝癌hdsFv?RC?RNase免疫毒素，通过在表达质粒中引入硫氧还蛋白基因和6×His基因，实现了免疫毒素在大肠杆菌中的可溶性表达，经过简单复性及亲合层析纯化等步聚，获得了对肝癌细胞具有特异性结合活性、稳定性强，具有一定杀伤作用的抗肝癌重组免疫毒素。

【】
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