尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCL?H446增殖的抑制作用

              作者：刘英杰 ，马远方， 刘广超， 吴雄文 

【摘要】  目的 研究尼美舒利对人小细胞肺癌细胞株NCL?H446增殖的抑制作用,为临床提供实验室依据。方法 常规培养人小细胞肺癌细胞株NCL?H446，MTT法检测尼美舒利的细胞毒性作用；倒置显微镜与Hoechst 33258荧光染色观察细胞形态学变化；流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率。结果 MTT显示尼美舒利呈剂量与时间依赖性抑制人小细胞肺癌细胞株NCL?H446的增殖；倒置显微镜下可见细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中。荧光显微镜下可见细胞核染色质致密浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎，凋亡小体形成等。FCM检测结果表明尼美舒利既可诱导NCL?H446细胞凋亡，又可引起坏死，400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后，细胞早期凋亡率为7.65%，晚期凋亡率为29.76%，细胞坏死占23.9%。结论 尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCL?H446有较显著的抑制作用,该作用与诱导细胞凋亡与坏死有关。

【关键词】  人小细胞肺癌细胞株NCL?H446； 尼美舒利； 细胞凋亡

    Inhibitory Effects of  Nimesulide on Proliferation of  Human  Small Cell  Lung Cancer Cell  Line NCL?H446

      Key words：Human small cell lung cancer;  Cell line NCL?H446；   Nimesulide；  Apoptosis

    近年来,选择性环氧化酶?2 抑制剂的抗肿瘤作用日益引起重视，尼美舒利（Nimesulide）是一种人工合成的环氧化酶?2特异性抑制剂, 其对人小细胞肺癌细胞株NCL?H446有无抑制作用国内外未见报道，本研究旨在通过MTT、倒置显微镜与荧光显微镜,流式细胞仪等实验方法观察尼美舒利体外对人NCL?H446细胞株的抑制作用,为临床小细胞肺癌的治疗提供实验室依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料  人小细胞肺癌细胞株NCL?H446购自院细胞库，尼美舒利购自Cayman公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清为TBD公司产品；MTT为sigma公司产品。FITC?Annexin V/PI 细胞凋亡检测试剂盒为BD公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  MTT法细胞毒性分析

    将对数生长期NCL?H446细胞制备成5×104/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板中,每孔200μl, 于37℃,5% CO2的培养箱中培养，24h后换为含有不同浓度尼美舒利(0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、 25、 50、 100、 200、 400、800μmol/ L)的培养液，对照组以正常培养液替代尼美舒利,每孔200μl，分别培养24、36、48、60、72h, 更换不含药物的培养液200μl/孔，并加入0.5%  MTT  20μl/孔，继续培养4h，弃上清，每孔加入150μl  DMSO,振荡10min，全自动酶标仪(Thermo Multiskan Ascent)测OD570吸收值。每一浓度设4个复孔，实验重复3次。细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

    1.2.2  细胞凋亡形态学观察

    在6孔板中放入盖玻片，加入含NCL?H446细胞的1640?10培养液，细胞密度为3×105/ml，2ml/孔，置37℃，5% CO2培养24h，弃去培养液，加入含400μmol/L尼美舒利的1640?10培养液2ml/孔，对照孔仍用正常培养液。置37℃、5%  CO2培养24h。倒置显微镜下观察细胞形态变化，将盖玻片取出，用PBS洗后，丙酮固定5min，再用PBS洗，Hoechst 33258染色10min，水洗，甘油封片，在荧光显微镜下观察细胞核形态变化并拍照。

    1.2.3  流式细胞仪检测NCL?H446细胞凋亡率

    收集并制备NCL?H446细胞悬液，加入24孔培养板，1ml/孔，细胞密度为105/孔，置37℃，5%  CO2培养24h，把培养液换为含400μmol/ L尼美舒利的1640?10，空白孔及对照孔仍用正常培养液，置37℃，5%  CO2温箱培养24h，收集细胞于小离心管中离心，用标记液洗一次，每孔细胞悬浮于100μl标记液中，加FITC?Annexin Ⅴ溶液及PI染液各5μl，混匀后避光室温放置15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况，Cellquest软件分析。

    2  结果

    2.1  MTT法尼美舒利对NCL?H446细胞的毒性作用

    MTT结果显示尼美舒利对NCL?H446细胞的体外增殖有较强的抑制作用，且存在时间和剂量依赖性。当尼美舒利浓度在25μmol/L以下时，其对NCL?H446细胞的抑制作用不明显，见图1、2。

    2.2  细胞凋亡形态学观察

    倒置显微镜下观察：在正常培养情况下NCL?H446细胞生长良好, 形态为多角形透明、折光性好、细胞铺展良好；经尼美舒利处理后,细胞变小、变圆、皱缩、部分细胞脱落飘浮于培养基中，并随尼美舒利作用时间的延长其飘浮细胞也增多。

    凋亡细胞荧光染色：400μmol/L尼美舒利作用24h后的NCL?H446细胞染色质浓缩、荧光强度增强、染色质边集、核破碎等细胞凋亡形态特征明显。而阴性对照细胞染色质疏松均匀，核着色均一，荧光相对弱，细胞核大小一致，见图3。

    2.3  流式细胞仪检测NCL?H446细胞凋亡率

    Annexin Ⅴ/PI双染，流式细胞仪检测结果表明尼美舒利既可诱导NCL?H446细胞凋亡，又可造成其坏死，400μmol/L的尼美舒利作用细胞24h后，细胞早期凋亡率为7.65%，晚期凋亡率为29.79%，细胞坏死占23.9%，见图4。

    3  讨论

    环氧化酶(cyclooxygenase,COX) 是分解花生四烯酸、生成各种内源性前列腺素(PG) 过程中重要的限速酶,催化产生的PG参与机体的多种生理及病理过程,如炎症、发热、出凝血机制等。目前认为COX有COX?1 和COX?2两种类型,后者为可诱生型COX,静止细胞中不易被测到，在一些刺激物刺激后,可以检测到COX?2表达增加。近年来研究表明,COX?2除了在炎症中发挥重要作用外,还与多种肿瘤的发生、和转移有关[1]。COX?2可通过以下机制参与肿瘤的发生发展[1?9]。①刺激细胞生长；②抑制细胞凋亡，其机制还不完全清楚,但至少有以下3 条途径:增加bcl?2表达、减弱一氧化氮(NO) 信号途径和降低细胞间神经鞘氨醇含量；③刺激新生血管形成；④增强肿瘤的侵袭和转移能力；⑤免疫抑制等。

    由于COX?2与肿瘤的关系比较密切。COX?2抑制剂在肿瘤防治中的应用逐渐受到重视，尼美舒利是一种选择性COX?2抑制剂，为磺酰胺类消炎镇痛药,能抑制炎症组织内前列腺素的合成,而不抑制胃黏膜内前列腺素的合成,因而能缓解炎症症状,对胃及十二指肠等的不良反应则较轻。本研究结果提示尼美舒利对体外培养的人小细胞肺癌细胞株NCL?H446有较显著的抑制作用, 且呈剂量与时间依赖性，该作用与其能诱导NCL?H446细胞凋亡与坏死有关。其诱导细胞凋亡与坏死的机制除了与抑制COX?2的表达有关外是否与其他机制有关有待进一步研究。

【】
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