祛毒胶囊对系统性红斑狼疮模型鼠免疫学机制的实验研究

          作者：王玉玺，王惠国，王俊志，王雅贤，王 丽

【摘要】  目的  研究祛毒胶囊系统性红斑狼疮（SLE）样小鼠的免疫学机制。方法  用LPS诱导昆明纯种小鼠制备了SLE样模型。灌胃15日后分别用ELISA法检测血清抗ds-DNA抗体、白介素10（IL-10）水平，用考马斯亮兰法检测小鼠24h尿蛋白的含量，镜下观察肝、肾病理改变情况。结果  祛毒胶囊具有降低ds-DNA抗体，抑制IL-10表达，减少小鼠的尿白蛋白，改善脏器组织的病理性改变的功能。结论  祛毒胶囊对SLE小鼠有一定疗效。
   
    【关键词】  祛毒胶囊；系统性红斑狼疮；白介素-10；ds-DNA
   
    系统性红斑狼疮（SLE）是一种典型的系统性自身免疫性疾病，其特征是多克隆B细胞异常活化、多种自身抗体的产生和T淋巴细胞调节异常［1］。研究发现，SLE发病中存在着细胞因子失常，性细胞因子失衡在SLE发病中起重要作用［2］。在临床实践中，根据凉血解毒、活血化瘀法组方的祛毒胶囊是笔者多年来治疗SLE行之有效的专用复方。本研究旨在通过对狼疮小鼠血清中的细胞因子白介素10（IL-10）及抗 ds-DNA抗体的测定来探讨祛毒胶囊治疗SLE的免疫学机制。
   
    1  材料与方法
   
    1.1  动物模型及分组  纯系昆明小鼠，20～22g，8～10周，雌雄各半，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。参照WHO免疫研究教学中心（WHO IMMUNOLOGY RESEARCH AND TRAINING CENTRE）Tito Cavallo［3］、Francisco［4，5］的报道方法造模，于造模前2h按分组灌胃给予相应药物。将75只小鼠随机分为5组，设A组为正常对照组，B组为模型对照组，给予等量的生理盐水灌胃；C组用祛毒胶囊水溶液治疗，给予生物0.5ml/（20g·d），浓度为4g/ml；D组用醋酸泼尼松治疗，0.5m/（20g·d），溶液浓度为0.312g/ml；E组用祛毒胶囊、醋酸泼尼松联合治疗，醋酸泼尼松给予溶液0.25ml/（20g·d），中药0.25ml/（20g·d）。
   
    1.2  药品与试剂  新药祛毒胶囊由黑龙江中医药大学提供。醋酸泼尼松，规格5mg×100片/瓶，上海信谊药业有限公司出品，批号：030401。LPS购于北京拜尔迪生物公司，目录号为L-2880。IL-10，anti ds-DNA试剂盒购于TPI Inc.17037 34thAve，Suite G Lynnwood，Washington 98003 U.S.A.考马斯亮蓝G250 (Fluka进口分装）。
   
    1.3  仪器  酶标仪，恒温箱，显微镜。
   
    1.4  血清IL-10、抗ds-DNA抗体含量的测定  于第15天采用摘眼球取血的方法制备血清标本，按试剂盒说明操作检测各项指标。
   
    1.5  考马斯亮蓝法检测蛋白尿  用牛血清白蛋白制作标准曲线，将测得的OD值带入标准曲线方程，得蛋白尿浓度。将蛋白尿浓度与24h尿量相乘，得到24h尿蛋白总量。
   
    1.6  SLE鼠肝肾病理检查  摘眼球处死小鼠后，取出肝、肾做石蜡切片观察病理改变。
   
    1.7  统计学方法  采用SPSS 10.0统计软件包进行统计学处理，所有资料均用(x±s)表示，采用多样本均数比较的方差分析法。
   
    2  结果
   
    2.1  祛毒胶囊治疗SLE样小鼠IL-10、ds-DNA、尿白蛋白水样的影响  见表1。模型组IL-10、抗ds-DNA抗体、2h尿白蛋白水平明显高于其他各组，差异有显著性（P＜0.05）。各药物治疗组对IL-10分泌的影响与空白组比较，差异无显著性（P＞0.05）。对ds-DNA抗体的影响，各药物治疗组间差异无显著性（P＞0.05）。对24h尿白蛋白水平的影响，中药组和联合用药组差异无显著性（P＞0.05）。

表1  祛毒胶囊治疗SLE样小鼠IL-10、ds-DNA、尿白蛋白水平的影响  (x±s)

注：*P＜0.05，**P＞0.05
   
    2.2  肝肾病毒改变  模型组动物肾小球毛细血管丛增生，充血，内皮细胞肿胀，集合管腔内见蛋白管型，近曲小管，基膜增厚。肝细胞严重脓肿，可见小灶性坏死，小叶中央静脉扩张淤血，汇管区内见有大量淋巴细胞浸润，并有少量胆色素颗粒。说明所造动物模型符合SLE病理改变特点（另外报道）。

    
    3  讨论
   
    细胞因子是活化的免疫细胞和某些基质细胞分泌的具有调节免疫功能的小分子多肽，在SLE免疫应答中起决定作用［2］。白介素10（IL-10）是近年来发现的重要免疫调节因子和抗炎因子，属Th2型细胞因子，主要由单核巨噬细胞、T和B淋巴细胞产生，是一种多效应的细胞因子。其主要的生物作用为抑制巨噬细胞的抗原提呈功能，抑制Th1型细胞INF-γ、IL-2、TNF-α等细胞因子的合成，是免疫系统中显示抑制作用的重要因子。大量试验证明Th2细胞因子合成增多，特别是IL-10的增多与SLE发病机制的关系最为密切［6］。SLE患者血清IL-10水平显著高于正常人，无论是初发者，还是病情反复发作者，无论是活动期还是缓解期，始终高于正常人。有临床试验显示：SLE病情活动与IL-10上调有关，提示异常表达的IL-10细胞因子对SLE有致病作用［7］。IL-10水平及表达能力与狼疮性肾炎（LN）、抗ds-DNA抗体有密切关系，IL-10是一种典型B细胞刺激因子，它可以刺激SLE病人外周血单个核细胞产生ds-DNA抗体，并诱导细胞凋亡，而抗ds-DNA抗体又能刺激单个核细胞分泌IL-10增加，二者形成恶性循环，导致病情进展［8］。抗双链DNA抗体（抗ds-DNA抗体）是能与天然DNA结合的自身抗体，只存在于SLE病人血清中，是目前公认的SLE的一种标志性抗体，它与SLE的发病，病理变化及预后有密切关系，该抗体的存在易引起LN和典型的蝶形红斑，且抗体滴度的升降与SLE的活动度相关。因此抗ds-DNA抗体的检测可作为判断SLE疾病活动的敏感指标。
   
    用LPS诱导小鼠制备的SLE模型，根据国内外的研究和我们的实验观察，用LPS造模后小鼠出现体温升高、严重腹水、大便溏泻、倦卧食少等现象，并出现蛋白尿，其肝肾病理表现与SLE患者症状极为相似，为狼疮鼠动物模型的成功建立提供了可靠的依据。本实验结果显示：SLE模型鼠的血清抗ds-DNA抗体，IL-10的水平明显高于对照组。
   
    肾上腺皮质类固醇激素目前仍是SLE的首选药物，有学者证实肾上腺皮质类固醇激素能抑制IL-10的分泌。本实验的结果显示：醋酸泼尼松可以抑制IL-10的分泌，消除蛋白尿及减少抗ds-DNA抗体的作用，用中药复方祛毒胶囊及两药联合治疗后，分别检测IL-10水平，其组间差异无显著性，说明祛毒胶囊有类似泼尼松样的免疫抑制作用，可有效的抑制B细胞的活化，减少Th2细胞因子，对SLE有治疗作用。
   
    祛毒胶囊其主要成分为秦艽、白花蛇舌草、雷公藤、紫草、丹参等，前三味药皆可兴奋垂体—肾上腺皮质系统，增强肾上腺皮质功能，发挥抑制炎症反应和特异性免疫反应的作用，而白花舌蛇草、雷公藤皆具有免疫抑制作用，尤其雷公藤对细胞免疫和体液免疫均具有显著的抑制作用，并能显著提高血清总补体含量和水平，阻止免疫复合物（IC）的形成，阻止其沉积于肾小球内，促进IC的清除，阻断其致炎作用。祛毒胶囊能有效减少或阻止IL-10的分泌，减少抗ds-DNA抗体，由此推论，免疫抑制和免疫调节是该复方中药治疗SLE在免疫学方面的重要机制之一。

【】

    1  Richaud PY，Akcicer VJ，Liorente L.High Levels of Th2 cytokine gene expression in systemic lupus erythematosus.Rev Invest Clin，1995，47(1)：267-272.    
    2  刘玉琴.细胞因子在系统性红斑狼疮中的异常表达.医学综述，2001，7(8)：455-456.    
    3  Cavall OT，Goldman M，Lambert PH.Animal model of human disease.Prdiferative glomerulone phritis associated with polyclonal B-cell activation.Am J Pathol，1984，114(2)：346-348.    
    4  Romos-Niembro F，Fournie G，Lambert PH.Induction of circulating immune complexes and their renal localization after acute or chronic polyclonal B-cell activation in mice.Kidney Ins Suppl，1982，2：29.    
    5  Izui S，Lambert PH，Fournie GJ，et al.Features of systemic lupus erythematosus in mice injected with bacterial lipepoly sacharides：identification of ciraulating DNA and reval localizatioon of DNA-anti-DNA complexes.J Exp Med，1997，145(5)：1115-1130.    
    6  陈志强，徐文严.系统性红斑狼疮中细胞免疫异常.国外医学·皮肤性病学分册，1998，24（2）：68-71.    
    7  Liorente L，Richand PY，Wijdenes J，et al.Spontaneous production of IL-10by Blymphocytes and monocytes in SLE.Eur Cytokine Net，1993，4：421.    
    8  王慧娟.IL-10在系统性红斑狼疮发病机制中的角色.国外医学·免疫学分册，2000，24（6）：319.