耐药性及基因类型检测

            作者：郑亚芬 周惠娜 承晓京 魏梓文

【摘要】  目的 了解新生儿感染产超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌分离株的耐药状况及β?内酰胺酶编码基因TEM、SHV、OXA、PER、GES、VEB、CTX型存在状况。 方法 将我院2004年7月新生儿病房感染的14株肺炎克雷伯菌用全自动微生物鉴定和药敏分析配套卡进行抗生素敏感性检测和ESBLs检测，并采用聚合酶链反应及序列分析方法分析菌株内的超广谱β?内酰胺酶基因型。结果 14株产ESBLs的肺炎克雷伯菌药敏结果一致，氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、头孢他啶均耐药对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦也耐药，对亚胺培南敏感。均检出blaCTX?M和blaTEM基因，未检出blaSHV、blaOXA、blaPER、blaGES和blaVEB基因。对blaTEM和blaCTX?M基因扩增产物测序，经BLAST程序分析基因为TEM?1和CTX?M?3型。结论 本院感染流行的ESBLs肺炎克雷伯菌耐第三代头孢菌素和耐酶抑制剂，基因类型为TEM?1和CTX?M?3。新生儿属于ESBLs的高危人群，新生儿病房产超广谱β?内酰胺酶菌感染应引起各方关注。

【关键词】  新生儿 超广谱β 内酰胺酶 肺炎克雷伯菌 基因类型

    Investigation of the antibiotics resistance and resistant?genotype of

       ABSTRACT  Objective  To investigate the antibiotics resistance of ESBLs producing Klebsiella pneumoniae (KPN) which were isolated from newborns and the genotype existence of TEM, SHV, OXA, PER, GES, VEB and CTX.  Methods  The antimicrobial susceptibility and ESBLs detection of fourteen KPN isolates from newborns in the Materity and Children Health Hospital of Changzhou, in July, 2004 were performed. The genotype of ESBLs from KPN were identified by polymerase chain reaction (PCR).  Results  Total of 14 KPN producing ESBLs were resistant to ampicillin, ceftriaxone, cefazolin, ceftazidime, amoxicillin/clavulanic acid and piperacillin/tazobactam, while sensitive to imipenem. All 14 KPN carried blaCTX?M gene and blaTEM gene, whereas blaSHV, blaOXA, blaPER, blaGES and blaVEB genes  were not detected. blaCTX?M gene and blaTEM gene were identified as blaTEM?1 and blaCTX?M?3.  Conclusion  The KPN isolated from newborns were resistant to the third generation cephalosporins and enzyme inhibitors, and the genotype were TEM?1 and CTX?M?3. As newborns are a high?risk group, it should be pay more attention to keep them from the ESBLs?producing KPN epidemic outbreak.

    KEY WORDS  Newborns;  ESBLs;  Klebsiella pneumoniae;  Genotype

    重症监护病房医院感染产超广谱β?内酰胺酶菌的分离株耐药性及其耐药基因研究国内已屡见报道［1～4］。新生儿医院感染产超广谱β?内酰胺酶菌的分离株的耐药性及耐药基因研究报道较为鲜见。2004年我院新生儿病房曾发生一次肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae，KPN)医院感染暴发。因根据药敏结果及时救治，患儿全部康复。现将当时分离到的14株肺炎克雷伯菌的耐药性和进行blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaPER、blaGES、blaVEB和blaCTX?M基因检测结果报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  临床资料

    2004年7月17日～7月19日新生儿病房14例患儿陆续出现体温升高，发热寒战。其中男患儿6例，女患儿8例，全部为早产儿，低体重儿，出生1～11d。患儿入院前大都体温正常，发热时随即抽血进行培养18～24h后均培养出肺炎克雷伯菌，根据药敏结果用亚胺培南/西司他丁3d后体温正常，6～9d患儿全部治愈，血培养转阴出院。

    1.2  菌株鉴定及药敏试验

    双相血培养瓶增菌后，用Bio?Merieux VITEK?32全自动微生物鉴定分析系统进行鉴定。药敏试验采用Bio?Merieux公司的GNS?120药敏卡，药敏试验结果判定依据CLSI/NCCLS(2004年)标准。

    1.3  产超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)检测

    由VITEK?32微生物鉴定仪专家系统直接判定。其原理与CLSI/NCCLS推荐的双纸片扩散法相似，根据4个检测孔(头孢噻肟、头孢噻肟+克拉维酸、头孢他啶、头孢他啶+克拉维酸)的生长浊度变化，当不加克拉维酸的生长浊度值比加克拉维酸的生长浊度≥50%即为阳性。标准菌株大肠埃希菌ATCC25922，肺炎克雷伯菌ATCC700603。

    1.4  β?内酰胺酶基因检测

    TEM、SHV、OXA、PER、GES、VEB和CTX?M型β?内酰胺酶基因通过PCR法检测，蛋白酶K消化法提取细菌DNA，引物序列见表1。反应体系为引物P1、P2各0.5μmol/L，dNTPs各200μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris?HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中板液5μl。热循环参数为：93℃预变性3min，然后按93℃1min→55℃1min→72℃1min，最后一个72℃延长至5min，共循环表1      ESBL酶编码基因PCR引物35周期。结果观察：取扩增产物10μl与电泳指示剂2μl混匀，点样与1%琼脂糖凝胶。以电压100V稳压电泳30min，凝胶成像仪中观察并记录图像。PCR试剂盒和阳性DNA由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    2  结果

    2.1  药敏结果

    14株KPN菌药敏试验结果相同(表2)。

    2.2  β?内酰胺酶基因检测结果

    14株KPN菌TEM、CTX?M基因型PCR检测均呈阳性。图1、2为blaTEM、blaCTX?M PCR检测电泳图。对表2 14株KPN菌15种抗生素敏感试验分子量标记由上而下分别为1000、900、800、700、600、500、400、300、250、200、150、100、50bp； CTX?M型基因PCR电泳图4株blaTEM基因扩增产物测序，经BLAST程序分析(www.ncbi.nlm.nih.gov)为blaTEM?1，与大肠埃希菌TEM?1型的基因序列片段(注册号：AB 194682)一致率100%。对1株CTX?M型扩增产物测序，经BLAST程序分析为CTX?M?3型，与大肠埃希菌CTX?M?3型的基因序列片段(注册号：AB185842)一致率100%。

    本研究中TEM?1、CTX?M?3型基因序列已成功注册GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov /nucleotide，注册号：DQ078258，DQ078259)。

    3  讨论

    抗菌药物的发现与应用使人类寿命至少延长了15年。但由于人、畜抗菌药物的过度使用，细菌的耐药率逐年上升。细菌耐药性已成为全球关注的公共卫生问题。专家估计，细菌耐药在21世纪对人类生命健康的威胁将不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病。革兰阴性杆菌β?内酰胺类耐药主要为产β?内酰胺酶。β?内酰胺酶最初为20世纪60年代发现，主要水解青霉素类抗菌药物，由blaTEM?1、blaTEM?2和blaSHV?1基因编码。后由于β?内酰胺类药物的过度使用，细菌长期暴露于药物中，编码基因发生突变，产生能同时耐青霉素、头孢菌素一至三代(部分可耐头孢菌素四代)药物，被称为超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)。目前已发现ESBLs编码基因家族除blaTEM、blaSHV外，还有blaCTX?M、blaOXA、blaPER、blaVEB、blaGES/IBC等。每个基因家族已发现的基因型有数个、数十个至百余个不等，产ESBLs菌有肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、产酸克雷伯菌、产气肠杆菌、摩氏摩根菌、奇异变形菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等革兰阴性杆菌［5～11］。

    本组14株氨苄西林、头孢曲松、头孢唑林、头孢他啶均耐药的KPN菌blaTEM、blaCTX?M基因PCR检测呈阳性，对4株TEM型基因扩增产物测序，经BLAST程序分析为blaTEM?1；对1株blaCTX?M型的基因扩增产物测序，经BLAST程序分析为CTX?M?3型。表型与基因型一致。14株KPN菌对亚胺培南敏感，因此亚胺培南/西司他丁有效。另外，14株KPN菌对阿莫西林/克拉维酸、哌拉西林/三唑巴坦耐药，即对酶抑制剂耐药。同时产广谱β?内酰胺酶和产超广谱β?内酰胺酶可表现为耐酶抑制剂［12］。最近，日本报道了新生儿ICU产GES?3型超广谱β?内酰胺酶KPN菌感染暴发流行［13］。新生儿属ESBLs的高危人群，特别是早产儿自身抵抗力弱，吸氧、吸痰等操作比较多，极易造成新生儿病房感染暴发流行。最近接受第三代头孢菌素治疗也是促进ESBLs产生和扩散的高度危险因素，因此特别要注意对高危人群合理使用第三代头孢菌素及其他广谱β?内酰胺类抗生素，重视耐药菌株的监测，的根据细菌培养和药敏结果指导抗生素的应用。

    本研究得到无锡市克隆遗传技术研究所糜祖煌老师的指导，特此致谢。

【】
  ［1］ 李耘，李家泰. ESBLs在大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌中检出率及情况比较［J］. 抗生素杂志，2005，30(3)：241

［2］ 黄支密，陈榆，毛培华，等. 鲍曼不动杆菌耐药性及β?内酰胺酶基因型研究［J］. 中华检验医学杂志，2003，26(11)：682

［3］ 余娴，凌保东，谢永恩，等. 临床分离耐药摩氏摩根菌的β?内酰胺酶表型和基因分析［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(11)：665

［4］ 李智山，邓三季，杨燕，等. 铜绿假单胞菌氨基糖苷类修饰酶分子流行病学研究［J］. 中华感染学杂志，2005，15(2)：134

［5］ 陆亚华，糜祖煌. 细菌耐药的遗传性基础及其分子机制［J］. 中国优生与遗传杂志，2005，13(1)：11

［6］ 糜祖煌，陆亚华，丁云芳，等. β?内酰胺酶TEM、SHV全长基因检测与应用［J］. 中华医院感染学杂志，2004，14(11)：1201

［7］ Naas T, Philippon L, Poirel L, et al. An SHV?derived extended?spectrum β?lactamase in Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1999,43(15):1281

［8］ Philippon L N, Naas T, Bouthors A T, et al. OXA?18, a class D clavulanic acid?inhibited extended?spectrum β?lactamase from Pseudomonas aeruginosa ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(10):2188

［9］ Girlich D, Poirel L, Leelaporn A, et al. Molecular epidemiology of the integron?located VEB?1 extended?spectrum β?lactamase in nosocomial enterobacterial isolates in Bangkok, Thailand ［J］. J Clin Microbiol,2001,39(1):175

［10］ Pagani L, Mantengoli E, Migliaracca R, et al. Multifocal detection of multidrug?resistant Pseudomonas aeruginosa producing the PER?1 extended?spectrum beta?lactamase in Northern Italy ［J］. J Clin Microbiol,2004,42(6):2523

［11］ Weldhagen G F, Prinsloo A. Molecular detection of GES?2 extended spectrum beta?lactamase producing Pseudomonas aeruginosa in Pretoria, South Africa ［J］. Int J Antimicrob Agents,2004,24(1):35

［12］ 俞云松. 超广谱β?内酰胺酶研究概况［J］. 中国抗生素杂志，2003，28(12)：712

［13］Wachino J I, Doi Y, Yamane K, et al. Nosocomial spread of ceftazidime?resistant Klebsiella pneumoniae strains producing a novel class A β?lactamase, GES?3, in a neonatal intensive care unit in Japan ［J］. Antimicrob Agent Chemother,2004,48(6):1960