酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物耐药表型与基因型研究

                   作者：肖永红 刘健 王哲 李耘

【摘要】  目的 研究酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药表型与基因型。方法 采用琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性；用双纸片法检测酿脓链球菌耐药表型；用PCR方法检测耐大环内酯的酿脓链球菌携带的耐药基因。结果 97株酿脓链球菌中82株表现为对大环内酯类抗菌药物不敏感，其中42株表现为cMLS型耐药，37株为iMLS型耐药，3株细菌为主动外排M型耐药；82株对大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因，其中12株具有ermB基因，25株具有ermTR基因，2株具有mefA基因，21株同时具有ermB/ermTR基因，5株同时具有ermB/mefA基因，3株同时具有ermTR/mefA基因，9株同时具有ermB/ermTR/mefA基因，5株未能检测到三种耐药基因。结论酿脓链球菌对大环内酯类抗菌药物的耐药率较高，耐药表型以cMLS和iMLS为主，耐药基因以ermB和ermTR多见。

【关键词】  酿脓链球菌 大环内酯类 耐药表型 耐药基因

    Macrolides resistant phenotype and genotype of Streptococcus pyogenes

      ABSTRACT  Objective  To investigate the macrolides resistant phenotype and genotype in Streptococcus pyogenes.  Methods  The minimum inhibitory concentrations of erythromycin, clindamycin, midecamycin, azithromycin, clarithromycin and penicillin against 97 clinical strains of Streptococcus pyogenes were tested with agar dilution method; the macrolides resistant phenotype and genotype of Streptococcus pyogenes were detected by D?test and polymerase chain reaction.  Results  Eighty?two Streptococcus pyogenes were non?sensetive to at least one macrolide agent. The strains with cMLS, iMLS and M resistant phenotype were 42, 37 and 3 respectively. Seventy?seven macrolides resistant strains were detected macrolide resistant genes, which were 12 strains with ermB, 25 strains with ermTR, 2 strains with mefA, 21 strains with both ermB and ermTR, 5 strains with both ermB and mefA, 3 strains with both ermTR and mefA, 9 strains with three genes, where as resistance genes were not detected in 5 isolats.  Conclusions  The macrolides resistance of Streptococcus pyogenes was highly prevalence in China. The major resistant phenotypes were cMLS and iMLS. ermB and ermTR were the main resistance genes.

    KEY WORDS  Streptococcus pyogenes;  Macrolides; Resistance;  Phenotype;  Genotype

    收稿日期：2006?04?17

    作者简介：肖永红，男，生于1965年，博士，教授。    酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes，Group A β?hemolytic Streptococcus，GAS)是急性呼吸道及皮肤软组织等感染的重要致病菌之一，常常引起人体各种化脓性炎症，临床常用青霉素、头孢菌素和大环内酯类药物进行。近年来，酿脓链球菌对不同抗菌药物尤其是大环内酯类的耐药性呈迅速增长趋势，我国的耐药监测数据显示，从儿童口咽部分离的GAS对红霉素的耐药率为43.3%［1］，2003年上海地区分离的GAS对红霉素、克林霉素的耐药率分别为78.6%和66.7%［2］。为了解酿脓链球菌对大环内酯类药物的的耐药机制，明确其耐药表型与基因型关系，指导临床合理用药，我们对97株酿脓链球菌进行了研究。

    1  对象和方法

    1.1  实验细菌    选择2001～2003年来自北京、哈尔滨、南京、天津四城市六家三级甲等、经临床分离的上呼吸道感染和皮肤软组织感染的酿脓链球菌97株，研究前经北京大学临床药理研究所细菌室重新鉴定。

    1.2  方法

    (1)最低抑菌浓度测定  采用CLSI/NCCLS标准的琼脂平板稀释法测定97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素、克拉霉素和青霉素的敏感性。抗菌药物标准品购自药品生物制品检定所；培养基及孵育条件：加5%羊血的MH琼脂，5% CO2环境35℃孵育24h；质控菌为金葡菌ATCC29213；结果判定参照CLSI/NCCLS 2001年标准。

    (2)耐药表型的检测  采用双纸片(D实验)法检测对任何一种大环内酯类耐药的酿脓链球菌的耐药表型，红霉素纸片(15μg)和克林霉素纸片(2μg)均购自中国药品生物制品检定所。将上述两种纸片间隔15～20mm均匀贴于涂布1.5×108CFU/ml菌液的5%羊血MH琼脂平板上，35℃ CO2孵箱孵育18～24h后观察，若细菌对红霉素与克林霉素均耐药，则为固有型MLS耐药(cMLS型)；若对红霉素耐药而靠近红霉素的克林霉素抑菌圈有缺损，呈“D”形改变，则为诱导型MLS耐药(iMLS型)；若对红霉素耐药而对克林霉素敏感，靠近红霉素的克林霉素抑菌圈无缺损，则为主动外排机制所致耐药(M型)。

    (3)耐药基因的检测  PCR检测对大环内酯类耐药的酿脓链球菌的耐药基因，并通过DNA测序确定。

    DNA模板的制备  采用SDS裂解法提取酿脓链球菌染色体DNA。

    引物序列  mefA：正向引物5′?AGTATCATTAATCACTAGTGC?3′，反向引物：5′?TTCTTCTGGTACTAAAAGTGG?3′；ermB：正向引物5′?CGAGTGAAAAAGTACTCAACC?3′，反向引物：5′?GGCGTGTTTCATTGCTTGATG?3′；ermTR：正向引物5′?AGGTTATAATGAAACAGA?3′，反向引物：5′?GCATGACATAAACCTTCA?3′。

    PCR扩增  应用50μl PCR反应体系扩增erm、mefA基因，包括5.0μl缓冲液，2.5mmol/L MgCl2，200μmol dNTP，50pmol引物1和50pmol引物2，2 U Taq DNA聚合酶，50ng DNA模板；PCR反应条件：预变性93℃ 3min，变性94℃ 1min，退火52℃ 1min，延伸72℃ 1min，再延伸72℃ 5min，共35个循环。mefA、ermB、ermTR基因扩增阳性片段大小分别为345、557和207bp，以1.5%琼脂糖凝胶，在1×TAE电泳缓冲液中100V电泳40min，溴化乙锭染色成像。

    序列分析  分别选取两株mefA、ermB、ermTR基因扩增阳性菌株的PCR产物送至北京奥科生物技术有限公司进行测序分析，确定扩增产物为目的片断。

    2  结果

    2.1  酿脓链球菌对大环内酯类耐药情况

    97株酿脓链球菌对红霉素、克林霉素、麦迪霉素、阿奇霉素和克拉霉素的耐药率分别为67.0%、45.4%、48.5%、72.2%和60.8%，未发现青霉素耐药菌株。酿脓链球菌对上述几种抗菌药物的MIC值及耐药率见表1。

    2.2  耐药表型的检测结果

    97株酿脓链球菌中82株表现为对大环内酯类抗菌药物中的至少一种不敏感，采用D试验检测其耐药表型，其中42株细菌表现为固有型耐药(cMLS)，占52.4%，37株为诱导型耐药(iMLS)，占43.9%，仅3株细菌为主动外排型耐药(M)，占3.7%。不同耐药表型酿脓链球菌对抗菌药物敏感性见表2。 表1    酿脓链球菌对不同抗菌药物的MIC测定结果表2  抗菌药物对不同耐药表型酿脓链球菌抗菌作用

    2.3  耐药基因的检测结果

    PCR结果表明，82株大环内酯不敏感的酿脓链球菌中77株检测到耐药基因，5株未检测到以上三种耐药基因，其中包括耐药表型为cMLS、iMLS型各2株、M型1株。大多耐药表型与基因型吻合，但一株M型检测到所有三种基因，而1株iMLS型仅检测到mefA基因，耐药基因的检测与分布情况见图1、表3。

    2.4  地区间耐药表型和基因型的差异

    本研究的酿脓链球菌来自北京、哈尔滨、南京、天津四个地区2001～2003年的临床分离菌，发现北京、天津和南京耐大环内酯GAS耐药表型以cMLS为主，所占比例分别为85.2%(23/27)，75.0%(3/4)，88.9%(8/9)， 而哈尔滨则以iMLS为主，所占比例为表3  耐大环内酯类酿脓链球菌的基因型与 表型检测结果

    3  讨论

    酿脓链球菌对大环内酯的耐药始于20世纪50年代，近年来随着大环内酯类药物广泛应用于临床，酿脓链球菌对其耐药性也显著增加。PROTEKT(1999～2000年度)监测结果显示［3］，包括日本、韩国、我国香港在内的亚洲地区，酿脓链球菌对红霉素的平均耐药率为18%，其中我国香港地区已达到28%；欧洲国家的平均耐药率为10%，但地区差异明显；澳大利亚的耐药率仅为4%。我国相关研究资料较为有限，整体来看，大环内酯耐药的酿脓链球菌发生率高于国外，在40%～90%之间［1～5］。

    细菌对大环内酯类耐药机制包括抗菌靶位改变(甲基化或变异)、主动外排、药物灭活等三种类型，链球菌耐药主要为前面两种［6］。编码抗菌靶位甲基化的基因为erm，表现为对大环内酯类、林可酰胺类、链阳霉素高水平耐药；编码主动外排的基因为mefA，表现为对14、15元环大环内酯类低度耐药；不同细菌耐药基因亚型不同，酿脓链球菌为ermTR、ermB和mefA，不同地区调查其耐药基因型与表型分布差别较大。PROTEKT(1999～2000年度)研究显示，来自全球143株耐大环内酯的酿脓链球菌中，以mefA基因介导的M表型所占比例最高(46.1%)，erm基因介导的cMLS表型位居第二(30.8%)，iMLS表型所占比例最低(23.1%)［7］。西班牙、德国、希腊、芬兰和意大利等国耐大环内酯酿脓链球菌以mefA基因介导的M表型为主［8～12］；法国以ermB、ermTR基因介导的MLS表型为主［13］；韩国、我国和香港以MLS表型为主［14～16］。

    本研究发现我国临床分离的酿脓链球菌不但对大环内酯耐药率较高，耐药水平也较高，如对红霉素的耐药率为67%，对阿奇霉素更高达72.7%，对克林霉素耐药率在45.4%，且MIC90均>256mg/L；耐药表型研

    表4        不同地区耐大环内酯类酿脓链球菌的基因型与表型检测结果(n=82)

    地区株数〖〗表  型cMLSiMLSM基  因  型ermBermTRmefAermB/ermTRermB/mefAermTR/mefAermB/ermTR/mefA全阳性北  京27232281192141哈尔滨428340224152242南  京430100001012天  津981020070000合  计824237312252215395

    究进一步证明高度耐药的MLS型为我国GAS的主要表型，所占比例达96.3%，远远高于欧美与周边国家水平，至于地区间存在的cMLS或iMLS表型与基因型间的差异，有待进一步研究；分子生物学结果显示，耐大环内酯GAS的基因型和表型一致，绝大多数细菌扩增到ermB、ermTR基因，mefA所占比例极低。这些结果与国外以mefA基因介导的M性低水平耐药为主情况不一致，而与我国周边地区和国家情况类似，这种高水平的耐药是否与我国长期应用大环内酯类药物有关尚待深入研究。

    长期以来，大环内酯类，特别是新型大环内酯类药物作为临床革兰阳性菌、非典型病原体感染的治疗药物得以广泛应用，但随着细菌对大环内酯耐药的流行，国外研究发现，即或是M型耐药细菌感染，大环内酯类治疗失败的机会明显高于敏感菌；结合本研究国内酿脓链球菌对大环内酯类高度耐药情况，临床选用大环内酯类治疗链球菌、葡萄球菌等革兰阳性菌感染很难获得满意疗效，临床医师在选用药物时必须加以重视。

    细菌耐大环内酯类erm、mef等基因大多携带于可传递耐药遗传物质，如质粒、转座子等，我国酿脓链球菌对大环内酯类何以呈现高水平耐药与高耐药率、细菌耐药与临床用药习惯的关系以及耐药基因型与国外差别等值得进一步研究；另外本次试验中发现5株耐药的酿脓链球菌未检测到三种耐药基因，2株细菌耐药表型与基因检测不一致，是否存在新的耐药基因型或者耐药基因表达差异，亦值得进行深入研究。

【】
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