耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药特征及耐消毒剂基因的检测分析

            作者：颜英俊 糜祖煌 刘华 杨洋 张凯 杨明清 黄文方

【摘要】  目的 分析和调查我院2005年1月～12月临床分离34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素耐药特点以及耐消毒剂相关基因携带状况。方法 应用BD Phoenix100全自动微生物分析仪进行细菌鉴定和17种药物敏感试验，头孢哌酮/舒巴坦采用KB法。用PCR方法检测季胺类(如苯扎溴铵)、双胍类(如氯己定)耐药相关基因qacEΔ1?sul1。结果 亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星100%敏感外，对哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦敏感率为48%～54%，对第三代及第四代头孢菌素、氨曲南和喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为3%～29%，对美罗培南敏感率为29%，对氨苄西林/舒巴坦、氯霉素、四环素、复方磺胺甲口恶唑全部耐药。34株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌有14株qacEΔ1?sul1基因阳性，携带率为41.2%。结论 本组亚胺培南耐药铜绿假单胞菌除对阿米卡星敏感外，对其它常用抗生素耐药严重，且耐消毒剂相关基因阳性携带率较高，应引起临床微生物和消毒界的重视。

【关键词】  铜绿假单胞菌 亚胺培南 消毒剂 耐药基因

    Investigation on the antimicrobial resistance characteristics

     ABSTRACT  Objective  To investigate the antimicrobial resistance characteristics and the condition of disinfectant?resistant gene (qacEΔ1?sul1) in 34 imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa.  Method  Thirty?four strains from patients from Jan to Dec 2005 were identified and drug susceptibility test were performed by BD Phoenix100 automatic microbial analysis system, cefoperazone/sulbactam susceptibility test was performed by Kirby?Bauer method. The qacEΔ1?sul1 gene was detected by PCR method.  Results  Imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa were all susceptible to amikacin, 48%～54% were susceptible to piperacillin and pipercillin/tazobactam,respectively. Only 3～29% were susceptible to the other cephlosporins, aztreonam and quinolones. There were 29% of Pseudomonas aeruginosa susceptible to meropenem and all resistance to amoxicillin/clavulanate, chloramphenicol, tetracycline and trimethoprim/sulfamethoxazole. Fourteen of 34 strains were qacEΔ1?sul1?gene positive, and the carrying rate was 41.2%.  Conclusion  The resistance status of Pseudomonas aeruginosa to imipenem is serious. There is high positive percentage of qacEΔ1?sul1 gene in imipenem?resistant Pseudomonas aeruginosa.

    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  Imipenem;  Disinfectants;  Resistance gene

    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是临床上常见的、重要的条件致病菌，同时也是感染常见的和主要致病菌。铜绿假单胞菌可引起多种感染，对多种常用抗生素耐药，给临床带来很大的困难。碳青霉烯类抗生素(如亚胺培南)以其广谱的抗菌活性，被临床广泛用于治疗重症感染。但近年来，由于外膜蛋白D2缺失、产酶、外排泵、生物膜等耐药机制［1，2］，铜绿假单胞菌对亚胺培南的敏感性逐年下降。2005年黄支密等［3］从多重耐药MRSA中发现耐消毒剂基因qacA。细菌耐消毒剂为获得性的qac基因所致，其中qacE?sul1基因由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性菌广泛获取［4，5］。为了解我院耐亚胺培南铜绿假单胞菌(IMPRPa)的耐药特点及消毒剂?磺胺耐药相关基因(qacEΔ1?sul1)存在状况，我们进行了相关分析和研究，现报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  菌株来源

    34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1月～12月我院住院患者的临床分离标本(包括痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等)。

    1.2  质控菌株

    铜绿假单胞菌ATCC27853和大肠埃希菌ATCC25922购自卫生部菌种保藏中心。

    1.3  菌株鉴定及药敏试验方法

    所有菌株均以BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，必要时采用ATB或传统生化方法补充鉴定。采用BD Phoenix100配套药敏试验复合板，包括阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、头孢噻肟、头孢他啶、氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、亚胺培南、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、头孢吡肟、四环素和复方磺胺甲口恶唑共16种抗生素，头孢哌酮/舒巴坦采用KB法，药敏标准按2005年版CLSI/NCCLS M100?S15规定执行。

    1.4  主要仪器设备与试剂

    Eppendorf centrifuge 5417R低温离心机，恒温金属浴(杭州大和公司)，MJ Peltier Thermal Cycler(MJ Research)，Bio?RAD电泳仪，Bio?RAD凝胶成像系统，琼脂糖(Oxoid公司)，100bp DNA Ladder Marker(大连宝生物工程公司)，6×上样缓冲液(北京天为时代公司)，头孢哌酮/舒巴坦药敏纸片(Oxoid公司)。

    1.5  模板DNA提取

    采用蛋白酶K消化法。

    1.6  基因扩增

    按美国国立生物技术信息中心(NCBI)已登陆的qacEΔ1基因序列(登陆号U12338)自行设计引物，P1：5′?TAGCGAGGGCTTTACTAAGC?3′，P2：5′?ATTCAGAATGCCGAACACCG?3′，扩增产物为300bp。优化后的PCR反应体系为：P1、P2引物各0.5μmol/L，dNTPs各200μmol/L，KCl 10mmol/L(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，Tris?HCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，Taq DNA聚合酶1U。全部反应体积20μl，其中模板液5μl。热循环参数为：93℃预变性3min→93℃ 30s→55℃ 30s→72℃ 60s，最后一个72℃延伸5min，共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

    1.7  结果判断

    取10μl扩增产物与2μl 6×上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶，在100V电压电泳30min，出现300bp的条带即为qacEΔ1?sul1基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。

    2  结果

    2.1  耐亚胺培南铜绿假单胞菌对常用抗生素的耐药

    耐药特征见Tab.1。

    2.2  耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐消毒剂

    34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌耐消毒剂基因阳性株14株，占41.2%，琼脂糖凝胶电泳结果见Fig.1。

    3  讨论

    亚胺培南是第一个应用于临床的碳青霉烯类抗生素，除了有些种属细菌(如嗜麦芽寡养单胞菌、黄杆菌属等)对亚胺培南天然耐药外，目前仍是革兰阴性杆菌感染最有效的抗生素。但近年来铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药性有逐年增加趋势［6，7］。铜绿假单胞菌是感染常见病原菌，由于耐药和多重耐药，对临床感染控制构成严重威胁，而对亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌具有更大的危险，因此铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药性和耐药机制研究引起国内外学者的广泛关注。我院34株IMPRPa全部对阿米卡星敏感(敏感率100%)，但对庆大霉素只有29%敏感，可能是阿米卡星对铜绿假单胞菌产生的氨基糖苷类钝化酶较稳定。哌拉西林和哌拉西林/三唑巴坦对铜绿假单胞菌有较强的抗菌活性，敏感率48%～54%，第三代及第四代头孢菌素、氨曲南、喹诺酮类等抗菌活性差，敏感率为3%～29%。有29%的IMPRPa对美罗培南敏感，提示铜绿假单胞菌对亚胺培南和美罗培南的耐药机制不尽相同。34株菌对氯霉素、复方磺胺甲口恶唑、四环素全部耐药，因此应加强细菌耐药监测和合理使用抗生素，避免IMPRPa引起医院感染流行。

    消毒剂通常分为高效、中效和低效三类，中效消毒剂因有较高的腐蚀性、刺激性，只用于医疗器具的消毒；低效消毒剂因无刺激性、无腐蚀性可用于人体皮肤、黏膜的消毒，这类消毒剂主要有季胺类消毒剂(如苯扎溴铵、度米芬)和双胍类消毒剂(氯己定等)。在我国这些消毒剂仍广泛用于伤口消毒，如眼部、膀胱、阴道冲洗消毒及外科前皮肤、黏膜准备和外科医生手消毒。

    qac基因家族表达多种化合物外排泵，细菌获得qac基因并表达，可将季胺类、双胍类和碱性染料排出菌体。目前发现的qac基因家族有qacA、qacB、qacC、qacD、qacE、qacE?sul1、qacF1?3等。其中耐消毒剂基因qacEΔ1?sul1是I类整合子的一部分，由整合子介导，可被革兰阳性和革兰阴性细菌广泛获取［3，4］。研究结果显示，34株IMPRPa菌qacEΔ1基因携带率较高，为41.2%。sul1为二氢蝶酸合成酶的编码基因，基因检测阳性提示细菌对磺胺类药物耐药。本组34株试验菌对磺胺类全部耐药，但只有41.2% sul1基因阳性，提示可能存在其它耐磺胺类的机制。

    综上所述，铜绿假单胞菌为医院感染常见菌，IMPRPa对常用抗生素耐药不容乐观以及较高的qacEΔ1?sul1基因携带率值得我国临床微生物和消毒界的广泛重视。

【】
  ［1］ 刘永芳，吕晓菊. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性［J］. 抗生素杂志，2005，30(11)：699

［2］ 谢轶，杨维清，贾文祥，等. 铜绿假单胞菌耐药性在生物被膜形成过程中的变化［J］. 中华微生物学和免疫学杂志，2005，25(4)：314

［3］ 黄支密，陈亚华，诸葛青云，等. 多重耐药MRSA耐消毒剂基因及抗生素耐药相关基因检测［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(5)：270

［4］ Kazama H, Hamashima H, Sasatsu M, et al. Distribution of the antiseptic?resistance gene qacE delta 1 in gram?positive bacteria ［J］. FEMS Microbiol Lett,1998,165(2):296

［5］ Kazama H, Hamashima H, Sasatsu M, et al. Distribution of the antiseptic?resistance gene qacE delta 1 in gram?negative bacteria ［J］. FEMS Microbiol Lett,1998,159(2):173

［6］ 陈亚红，姚婉贞，刘振英，等. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性［J］. 中国抗感染化疗杂志，2004，4(2)：112

［7］ 辜依海，罗燕萍，张文莉，等. 耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药性分析及金属β?内酰胺酶检测［J］. 中华医院感染学杂志，2005，15(3)：339