耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药机制研究

             作者：方平 潘晓龙 周东升 吴祥林

【摘要】  目的 研究鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药机制。方法 对临床分离的3株耐亚胺培南的鲍曼不动杆菌，采用KB纸片扩散法(CLSI/NCCLS 2004年标准)进行药敏试验，三维试验检测ESBLs和AmpC酶，PCR方法检测TEM、SHV、PER、VEB、AmpC、IMP、VIM、OXA?23和OXA?24等9种耐药基因型，PCR阳性产物进行基因测序，结果在GenBank基因库中比对分析。结果 3株鲍曼不动杆菌为多重耐药菌株，三维试验均产生ESBLs，1株产生AmpC酶，耐药基因型检测3株TEM阳性，2株PER阳性，2株AmpC酶阳性及SHV、VEB和IMP、VIM、OXA?24型等均为阴性；3株OXA?23型均阳性；另外27株对亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌IMP、VIM、OXA?23和OXA?24型检测结果均阴性。结论 耐亚胺培南鲍曼不动杆菌携带TEM、PER、非诱导AmpC酶、OXA?23型碳青霉烯酶基因，产生OXA?23型碳青霉烯酶是主要耐药机制。

【关键词】  鲍曼不动杆菌 OXA?23型碳青霉烯酶 耐药基因型

    Mechanism of imipenem?resistance in Acinetobacter baumannii

     ABSTRACT  Objective  To study the mechanism of imipenem?resistance in Acinetobacter baumannii. Methods  Antimicrobial susceptibility test was done on 3 strains of Acinetobacter baumannii isolated in Tongling by Kirby?Bauer method. Results were assessed according to the standands recommended by  CLSI/NCCLS (2004). The detection of ESBLs and AmpC β?lactamases was performed by three?dimensional test, the genotype of TEM, SHV, PER, VEB, AmpC, IMP, VIM, OXA?23, OXA?24, and the detection and sequence analysis was performed by polymerase chain reaction (PCR).  Results  Three strains in Acinetobacter baumannii were multi?drug resistant. Three strains of imipenem?resistance were positive for blaTEM gene, 2 strains had blaPER gene, and 2 had ampC gene, OXA?23 type gene were detected in these three isolates, but no SHV, VEB, IMP, VIM and OXA?24 type gene was detected. Twenty?seven strains of imipenem?susceptibility in Acinetobacter baumannii were negative for IMP, VIM, OXA?23 and OXA?24.  Conclusions  Acinetobacter baumannii carried TEM, PER, AmpC and OXA?23 type gene, production of OXA?23 carbapenemase in Acinetobacter baumannii was one of the main mechanisms of imipenem resistance the Tongling People′s hospital.

    KEY WORDS  Acinetobacter baumannii;  OXA?23 carbapenemase;  Resistant genetype

   鲍曼不动杆菌是院内感染的重要病原菌之一。随着广谱抗菌药物的大量使用，抗生素选择性压力不断增加，鲍曼不动杆菌的分离率呈逐年上升趋势，对抗菌药物的耐药性日益严重，甚至出现了对目前常用抗菌药物包括亚胺培南在内均耐药的多重耐药菌株，给临床带来很大困难。鲍曼不动杆菌的耐药机制复杂，包括产生各种β?内酰胺酶和各种修饰酶、外膜蛋白的丢失或膜孔蛋白缺损、青霉素结合蛋白的改变和泵出机制等，其中以产生各种β?内酰胺酶为主要机制［1，2］。对我院近期分离的3株对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌进行β?内酰胺酶基因型检测，以探讨鲍曼不动杆菌的耐药机制。

1  材料与方法

    1.1  菌株来源

    31株多重耐药鲍曼不动杆菌来自我院2004年7月～2005年3月临床分离的标本，其中3株对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌为a4001、a009、a023，脑外科1份、呼吸科1份、ICU 1份。细菌均经Vitek?32型全自动微生物鉴定仪Vitek?GNI鉴定卡统一进行鉴定。

    1.2  标准菌株

    TEM?26型大肠埃希菌和高产AmpC酶阴沟肠杆菌029M标准株由安徽医科大学第一附属惠赠；大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603由本实验室保存。

    1.3  药敏试验

    采用KB［CLSI/NCCLS(2004)标准］纸片扩散法，药敏纸片：阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/三唑巴坦、替卡西林/克拉维酸、头孢呋辛、头孢曲松、亚胺培南、头孢他啶、头孢噻肟、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、头孢哌酮、头孢哌酮/舒巴坦、甲氧苄啶/磺胺甲口恶唑为英国Oxoid公司产品，庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星、环丙沙星为北京天坛药物品鉴定所生物技术开发公司产品。MH琼脂为法国Bio?Merieux公司产品；质粒碱裂解提取试剂、染色体DNA提取试剂、PCR扩增试剂盒为上海申能博彩生物公司产品。

    1.4  主要仪器设备

    法国Bio?Merieux公司生产的Vitek?32型全自动微生物鉴定仪；日本Sanyo MDF?382型超低温冰箱；德国Hettich公司产品MIKRO 22R型低温超速离心机；美国PERKIN ELMER公司9600型基因扩增仪；美国SHELLAB水套式恒温培养箱；北京六一DYY?11B型电泳仪。

    1.5  三维试验检测ESBLs和AmpC酶

    参照Coudron［3］和吴伟元［4］报告的酶提取物三维试验作部分改进。

    1.6  PCR方法检测耐药基因

    采用碱裂解法和蛋白酶K法提取被测细菌质粒基因和染色体基因，耐药基因引物根据GenBank提供的耐药基因采用primer软件设计引物，部分引物序列有关［5］(表1)，引物由上海申能博彩生物公司合成。PCR产物在含0.5μg/ml溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，在紫外光线下观察结果，在凝胶成像系统上成像。1.7  基因测序

    PCR阳性产物送上海申能博彩生物公司进行基因测序，结果在GenBank基因库中比对分析。

    2  结果

    2.1  药敏结果

    3株鲍曼不动杆菌表现为多重耐药，结果见表2。

    2.2  三维试验结果

    3株鲍曼不动杆菌ESBLs均阳性，a4001号AmpC酶阳性。

    2.3  耐药基因检测结果

    3株对亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌9种基因型的检测结果见表3，各种耐药基因PCR阳性产物凝胶电泳见图1，另外27株鲍曼不动杆菌blaIMP、blaVIM、blaOXA?23和blaOXA?24检测结果均阴性。表1    用于检测耐药基因的引物表3   PCR基因扩增耐药基因情况

    2.4  测序结果

    a009株PER型PCR扩增阳性产物在BLSAT网上比对分析，与目标基因(Z21957)有100%的同源性；a4001AmpC酶基因PCR阳性产物与染色体介导的高产AmpC酶目标基因(AJ009979)有99%的同源性；OXA?型PCR扩增阳性产物测序结果比对分析与OXA?23(AF201828)产碳青霉烯酶基因的序列有99%的同源性。

    3  讨论

    3株鲍曼不动杆菌均产生TEM型β?内酰胺酶，可能为广谱β?内酰胺酶，到目前为止国内尚未发现TEM型超广谱β?内酰胺酶。Bou发现［6］，以质粒介导的TEM?1型广谱β?内酰胺酶存在于多重耐药鲍曼不动杆菌中，PCR检测发现，有25%的鲍曼不动杆菌产生TEM型β?内酰胺酶，该酶可以广泛水解第一代头孢菌素类和对酶不稳定的第一代青霉素类抗生素，尽管该酶在鲍曼不动杆菌的多重耐药中可能不是主要角色，仍是其耐药机制之一。产SHV型广谱β?内酰胺酶的鲍曼不动杆菌在国外报道较少，但在我国浙江地区已证实其存在［7］，多为SHV?12型，而在这3株鲍曼不动杆菌中并未发现SHV型β?内酰胺酶。

    产ESBLs blaPER?1基因首先在法国发现于铜绿假单胞菌，后来在土耳其相继发现blaPER?1基因编码产ESBLs的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌［8］，在韩国的不同也发现PER?1型产ESBLs鲍曼不动杆菌，国内浙江杭州某医院有暴发流行产该类酶基因的菌株报道［7］。我院3株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中，发现有2株产ESBLs blaPER?1型质粒基因，对鲍曼不动杆菌多重耐药菌的产生有重要意义。

    VEB?1酶首先在泰国的铜绿假单胞菌中被发现，之后在法国的一家医院暴发流行的多重耐药的鲍曼不动杆菌中被检出blaVEB?1基因。该基因定位在染色体上，是I型整合子的一个部分，含有blaVEB?1的整合子与在泰国发现的铜绿假单胞菌携带的blaVEB?1整合子相同。我院3株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌中未发现blaVEB?1基因。

    以染色体介导的高产AmpC酶在鲍曼不动杆菌的多重耐药中有重要意义，产AmpC酶鲍曼不动杆菌普遍存在。在西班牙一所医院暴发的鲍曼不动杆菌感染中，发现染色体上携带有ampC基因编码的pI为9.4的AmpC酶［9］，其氨基酸序列与C类头孢菌素酶密切相关。该酶可被舒巴坦、三唑巴坦适量抑制，被克拉维酸微弱抑制。利用三维试验检测AmpC酶有重要的价值，表明鲍曼不动杆菌产生的AmpC酶不需要诱导剂诱导就可产生大量AmpC酶，与基因检测结果有较高的一致性(95%以上)，a4001号AmpC酶阳性产物测序结果比对分析与目标基因有99%同源关系。

    鲍曼不动杆菌对亚胺培南的耐药主要是由于产生了碳青霉烯酶。碳青霉烯酶是指能够明显水解至少亚胺培南或美罗培南的一类β?内酰胺酶，它包括A、B和D三类酶，其中B类为金属酶，属于Bush［10］分群中的第3组，见于铜绿假单胞菌、不动杆菌和肠杆菌科细菌；A类、D类为丝氨酸酶，属于Bush分群中的第2f和2d亚组，A类酶见于一些肠杆菌科细菌，D类酶仅见于不动杆菌。B类金属酶常见有IMP和VIM型β?内酰胺酶，A类酶少见，有NMC?A、Sme和IMI?1型，D类碳青霉烯酶按同源性可分为2组：第1组包括OXA?23和OXA?27，它们只差2个氨基酸，同源性达99%，第2组包括OXA?24，OXA?25，OXA?26，同源性98%。两组之间的同源性仅为60%，但与其他不能水解碳青霉烯类的OXA型酶相比，亲缘性已经很高了。本研究3株耐亚胺培南鲍曼不动杆菌未发现产生IMP和VIM型β?内酰胺酶和OXA?24，但都产生OXA?23型碳青霉烯酶，3株扩增产物测序结果与目标基因blaOXA?23有99%同源性，其他28株对亚胺培南敏感鲍曼不动杆菌IMP、VIM型β?内酰胺酶和OXA?23、OXA?24型基因均未检测到，说明本地区耐亚胺培南鲍曼不动杆菌耐药机制主要是产生OXA?23型碳青霉烯酶。

    总之，我院耐亚胺培南鲍曼不动杆菌主要与携带TEM广谱β?内酰胺酶基因、ESBLs blaPER?1基因和非诱导AmpC酶基因以及产生OXA?23型碳青霉烯酶有关，其中产生OXA?23型碳青霉烯酶是主要耐药机制，是否存在膜(孔)蛋白的缺失或丢失以及其它机制有待进一步研究。

【参考】
  ［1］ Germán B, Gonzalo C, M. Angeles D, et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistant Acinetobacter baumannii strain with a carbapenem?hydrolyzing enzyme: high?level carbapenem resistance in A.baumannii is not due solely to the oresence of β?lactamases ［J］. J Clin Microbiol,2000,38(7):3299

［2］ 张永，唐英春，陆坚，等. 鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药分子机制的研究［J］. 抗生素杂志，2005，20(4)：217

［3］ Coudron P E, Moland E S, Thomoson K S. Occurrence and detection of AmpC beta?lactamases among Escherichia coli, Klebsiella Pneumoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veteran′s medical center ［J］. J Clin Microbiol,2000,38(4):1791

［4］ 吴伟元，陈民钧，王辉. 阴沟肠杆菌去阻遏持续高产AmpC酶和超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)的检测 ［J］. 中国临床药杂志，2001，17(2)：9

［5］ Mariya A S, Neil W, David M L. Characterization of OXA?25, OXA?26, and OXA?27, molecular class D β?lactamase associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2001,45(3):583

［6］ German B, Martinez?Beltran J. Cloning, nucleotide sequencing, and analysis of the gene encoding an AmpC β?lactamases in Acinetobacter baumannii ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(2):428

［7］ 黄支密，陈榆，毛培华，等. 鲍曼不动杆菌耐药性及β?内酰胺酶基因型研究［J］. 中华检验医学杂志，2003，11(9)：683

［8］ Vahaboglu H, Ozturk R, Aygun G, et al. Widespread detection of PER?1?type extended?spectrum beta?lactamases among nosocomial Acinetobacter and Pseudomonas aeruginosa isolates in Turkey: a nationwide multicenter study ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1997,41(9):2265

［9］ Alejandro B, Lourdes D, Anna R, et al. Molecular characterization of the gene encoding a new AmpC β?lactamase in a clinical strain of Acinetobacter genomic species 3 ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2004,48(6):1374

［10］ Bush K, Jacoby G A, Medeiros A A. A functional classification scheme for β?lactamases and its correlation with molecular structure ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1995,39(6):1211