金黄色葡萄球菌耐消毒剂基因qacA的研究

【摘要】  目的 检测我院近年来临床分离的金葡菌耐消毒剂的qacA基因水平，为动态监测细菌耐药性的变化趋势、有效控制细菌耐药性的传播提供对策。方法 收集我科临床分离的金葡菌共252株，并经本实验室重新鉴定确认。参照美国CLSI/NCCLS标准，用6μg/ml苯唑西林和4% NaCl平板，筛选出耐苯唑西林金葡菌和对苯唑西林敏感的金葡菌。应用PCR基因扩增试验检测金葡菌中耐消毒剂的qacA基因水平。随机抽取一株MRSA阳性株进行基因测序，作qacA基因验证。作qacA基因阳性株的MIC检测，了解阳性株是否有耐药性的表达。结果 共检测金葡菌252株，其中MRSA 84株(带有qacA基因4株)，MSSA 168株(带有qacA基因1株)。MRSA阳性菌株对消毒剂的MIC值明显高于MSSA菌株。结论 携带含有耐消毒剂基因qacA的金葡菌未在我院流行。

【关键词】  金黄色葡萄球菌 消毒剂 qacA基因

    Study on the disinfectant?resistant gene qacA in Staphylococcus aureus

        ABSTRACT  Objective  To investigate the disinfectant?resistant gene qacA in Staphylococcus aureus isolates from the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University and control drug?resistance transmission of bacteria.  Method  Two hundred and fifty?two Staphylococcus aureu isolates were collected and reconfirmed by our laboratory. The agar plate containing oxacillin 6μg/ml and 4% NaCl was used to select methicillin?susceptible Staphylococcus aureus and methicillin?resistant Staphylococcous aureus, according to the standard recommended by CLSI/NCCLS (2005) of USA. The qacA gene in the isolates were amplified by PCR. The PCR products were sequenced for verification with the object sequence of GenBank. The drug?susceptible test was performed in qacA carrying stains.  Results  Among 252 Staphylococcous aureus isolates, only 4 strains were found qacA gene in 84 MRSA and 1 strain in 168. The MICs of antiseptics were higher against MRSA than MSSA.  Conclusion  Disinfectant?resistant gene qacA ?carrying Staphylococcus aureus hasn′t previled in the hospital.

    KEY WORDS  Staphylococcus aureus;  Disinfectants;  qacA gene

    金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是临床上最常见的致病菌之一，其产生的毒素和酶最多，毒力在葡萄球菌中最强，尤其耐甲氧西林金葡菌(methicillin?resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是内感染的主要病原菌，MRSA具有多重耐药特征，是临床抗感染的难题之一。20世纪80年代国外学者已在金葡菌中检测到耐消毒剂基因qacA，2005年我国也从多重耐药MRSA中发现耐消毒剂基因qacA的报道［1］。

    金葡菌对消毒剂的耐药基因命名来源于其对季胺类化合物(quaternary ammonium compounds，qac)的耐药，主要由qacA、qacB和qacC的基因编码，依靠细菌细胞内质子动力的多药外排系统来达到耐药。qacA、qacB和qacC属于主要易化子超家族(majorfacilitator superfamily)和小的多重耐药家族［2］。qacA基因介导对单价有机阳离子(如溴化乙啶、苯甲烷胺和西曲溴铵)和二价有机阳离子(如氯己定、喷他脒等)消毒剂的耐药，qacA基因常位于多种质粒上，包括pSK1家族，亦可位于染色体上。其表达的蛋白为QacA。QacA依靠质子运动力(即形成经典的michaelis?mentan)的反向转运来达到从菌体细胞内外排消毒剂的目的［3，4］。qacB对单价有机阳离子和低水平的二价有机阳离子复合物耐药，存在于数个质粒上，包括重金属耐药质粒pSK23上。qacA和qacB具有高度同源性，经基因测序发现两者仅有7个碱基不同，表达上仅有一个氨基酸的不同，不能用PCR和Southern blotting的检测方法区别开来，在核苷酸323位上，QacA为天冬氨酸(Asp)，QacB为丙氨酸(Ala)，但这种随机或定点突变却引起了他们对耐药表达的不同［5］。qacC基因则被证明与qacD、ebr和smr基因相同，仅仅是不同中名字的不同，介导对季胺类化合物和溴化乙啶的耐药，通常位于临床分离的金葡菌和其他葡萄球菌的结合和非结合质粒上［6～9］。

    本实验的主要目的是检测我院临床分离的252株金葡菌，了解qacA基因的检出水平及是否在我院流行，为有效控制医院内感染和切断可能引起细菌耐药性传播的途径提供一个动态观察的方法。

    1  实验材料

    1.1  细菌来源

    所用菌株为我院近年临床分离的金葡菌，菌株来自住院患者痰液、尿液、胆汁、脑脊液及伤口、烧伤创面脓性分泌物，每位患者同一时期同一部位只取一份标本。阳性菌株TS77由日本东京药科大学病原微生物教研室野口雅久教授赠送。MIC质控菌金葡菌ATCC29213和金葡菌ATCC25923为我科菌库所存。

    1.2  试剂

    (1)PCR试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司)、蛋白胨(日本制药株式会社)、牛肉浸膏(上海长阳生化制药厂)、EDTA Tris(BBI)、NaCl(重庆北碚化学试剂厂)、Agarose Regular(宝生物工程有限公司)、苯唑西林(含量90.4%，重庆药检所提供)，吖啶黄(acriflavine，AF)、洁尔灭(benzalkoniumchloride，BKC)、苄索氯铵(benzethonium chloride，BTC)、溴化乙啶(ethidiumbromide，EB)、派洛宁Y(pyronin Y，PY)由美国Sigma公司提供。

    (2)DNA Marker  DL1200：北京天为时代科技有限公司1200、900、700、500、300、100(bp)；DL2000：上海生工生物工程技术服务有限公司2000、1000、750、500、250、100(bp)。

    (3)qacA基因的PCR扩增引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)  根据PUBMED基因库中公布的基因序列用primer5.0设计引物，并文献［1］碱基序列为：

    P1：5′?GCTGCATTTATGACAATGTTTG?3′，

    1629?1714，629bp

    P2：5′?AATCCCACCTACTAAAGCAG?3′，

    2301?2321

    1.3  主要仪器

    PCR仪(MJ research PTC?200)，核酸电泳仪(CLP)、天平(北京医用天平厂)、超净台(苏净集团安泰公司)、恒温箱(南京实验仪器厂)、凝胶成像系统(BIORAD)、天平(AB104?N)、制冰机(日本SANYON公司)、麦氏比浊管(法国Bio?Merieux公司)、微型离心机(Eppendorf)、多点接种仪(日本株式会社佐久间制作所)。

    2  实验方法

    2.1  MRSA和MSSA的筛选

    用含6μg/ml苯唑西林和4%高渗NaCl(W/V)的琼脂平板进行鉴定［10，11］，35℃孵育24h，有>1个菌落为耐药，用透射光仔细检查有无菌落或薄膜状生长，质控菌金葡菌ATCC29213为敏感株，TS77为耐药株。

    2.2  PCR基因扩增试验

    (1)反应条件  93℃ 2min，一个循环；93℃ 20s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃ 5min。总反应体积为50μl。

    (2)产物鉴定  电泳鉴定：1%琼脂糖凝胶，电压80V，时间25min，加样5μl。

    2.3  PCR产物测序

    从PCR产物中随机取一株MRSA阳性株进行碱基序列测序，以核实产物的可靠性。

    2.4  阳性株MIC的测定

    用琼脂二倍稀释法。菌落生长被完全抑制的最低药物浓度为该药对检测菌的MIC，单一菌落生长可忽略不计。

    3  实验结果

    (1)共检测金葡菌252株，其中84株为MRSA，占33.3%(84/252)；168株为MSSA，占66.7%(168/252)。

    (2)MRSA中发现qacA基因阳性株4株，占4.73%(4/84)，MSSA中有1株，占0.6%(1/168)。阳性株测序后与阳性对照株的序列相同。

    (3)实验结果电泳图见Fig.1。

    (4)所测菌的MIC值见Tab.1。    Lanes from 2 to 6: S.aureus strains carrying gene qacA;

    Lane 1: Positive stain;  Lane 7: Negative strain

    Fig.1    Results of detecting the gene qacA

    Tab.1    The susceptibility of positive strains

    Strains  qacA

    geneMIC (μg/ml)EBBKCPYBTCAF#30 (MRSA)+25664256  64  64#770 (MRSA)+32441  8#791 (MRSA)+32481  8#39 (MRSA)+25664128  128  64#937 (MSSA)+16210.54ATCC25923-  22  0.5  0.252TS77+1284832  32

    AF: Acriflavine;  BTC: Benzethonium chloride;

    BKC: Benzalkonium choride;  EB: Ethidium bromide;

    PY: Pyronin Y.

    4  讨论

    金葡菌对消毒剂的耐药性研究在国内少有报道，仅见浙江陆亚华和黄支密的报道，细菌样本数较少。国外早期英国和澳大利亚研究较多，近期日本的研究亦渐多，且研究较为深入。金葡菌是临床上最常见的致病菌，甲氧西林耐药的金葡菌MRSA对多种药物呈现多重耐药，并可引起内的广泛传播，临床上对其处理方法主要是通过消毒剂来清除和阻断其进一步的扩散，而一旦金葡菌对消毒剂产生耐药性，将会带来严重后果。MRSA产生的一个主要原因是金葡菌获得了新的青霉素结合蛋白PBP2a。通常金葡菌中有4种PBPs：PBP1、PBP2、PBP3和PBP4，它可催化细菌细胞壁的生物合成。甲氧西林等β?内酰胺类抗菌药物可与PBPs结合使其失去催化活性，抑制细菌细胞壁合成，达到杀菌作用。PBP2a与β?内酰胺类抗菌药物亲和力低，可使细菌免受β?内酰胺类抗菌药物抑制作用的干扰。通过对我院近年收集的252株金葡菌的检测，对我院的微生态环境有一初步的了解，即携带耐消毒剂基因qacA的金葡菌并未在我院引起流行。Noguchi等［12］1999年在日本的调查中发现，MRSA中qacA/B和qacC的检出率分别为10.2%(10/98)和20.4%(20/98)，而到2005年［13］，MRSA中qacA/B和qacC的检出率已分别达47.9%(198/413)和3%(14/413)。Mayer等［14］2001年在欧洲部分医院的调查中发现MRSA中qacA/B和qacC的检出率为分别为62.6%(186/297)和6.4%(19/297)，2005年黄支密等［1］报道20株MRSA，结果20株均检出qacA基因，检出率为100%(20/20)。我院分离出84株MRSA中qacA检出率仅4.73%(4/84)，与国内外资料报告的结果有较大差异。从Tab.1可以看出，EB的MIC值在2～256μg/ml之间，BKC的MIC值在2～64μg/ml之间，PY的MIC值在1～256μg/ml之间，BTC的MIC值在0.5～128μg/ml之间，AF的MIC值在2～64μg/ml之间。可见带有qacA基因的MRSA对消毒剂具有高度耐受性，而携带qacA基因MSSA的MIC值则明显小于MRSA的MIC值，说明带有qacA基因的MSSA并未表达，而带有qacA基因的MRSA则普遍有表达。

    本实验使用的PCR基因扩增方法简单、可靠，国内使用时均通过提取质粒为模板，再进行PCR扩增。金葡菌的细胞膜较厚，用一般的质粒抽提方法提取较为困难，须用溶葡萄菌素和蛋白酶K，但这两种试剂价格昂贵、费时、步骤繁琐。本实验此次检测菌株数多，具有较好的可信度和性，可供研究细菌耐药性的科研工作者。

【参考文献】
  ［1］ 黄支密，陈亚华，诸葛青云，等. 多重耐药MRSA耐消毒剂基因及抗生素耐药相关基因检测［J］. 抗生素杂志，2005，30(5)：270

［2］ Putam M, van Veen H W, Konings W N. Molecular properties of bacterial multidrug transporters ［J］. Microbiol Mol Biol Rev,2000,64(4):672

［3］ Tennent J M, Lyon B R, Skurray R A, et al. Physical and biochemical characterization of the qacA gene encoding antiseptic and disinfectant resistant in Staphylococcus aureus ［J］. J Gen Microbiol,1989,135(1):1

［4］ Brown M H, Skurray R A. Staphylococcal multidrug efflux protein QacA ［J］. J Mol Microbiol Biotechnol,2001,3(2):163

［5］ Sekiguchi J I, Hama T, Fujino T, et al. Detection of the antiseptic?and disinfectant?resistant genes qacA, qacB and qacC in methicilin?resistant Staphylococcus aureus isolated in a Tokyo Hospital ［J］. J Infect Dis,2004,57(6):288

［6］ Grkovic S, Brown M H, Roberts N J, et al. QacR is a repressor protein that regulates expression of the Staphylococcus aureus multidrug efflux pump QacA ［J］. J Biol Chem,1998,273(29):18665