二重实时PCR快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
【摘要】 目的 建立二重实时聚合酶链反应(duplex real?time PCR)快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)。方法 采用二重SYBR Green实时PCR快速检测MRSA的决定基因mecA和金葡菌的种特异性基因nuc，经熔解曲线分析鉴定产物。结果 所有MRSA菌株的熔解曲线均呈现mecA、nuc基因特异性的峰，甲氧西林敏感的金葡菌仅有nuc峰，耐甲氧西林的表葡菌仅有mecA峰，甲氧西林敏感的表葡菌与其他菌种的菌株无特异峰出现；当MRSA菌浓度达102cfu/ml时就可检出。在131株金葡菌中，30.53%(40/131)耐药；二重实时PCR扩增mecA基因29.01%(38/131)阳性，nuc基因100%阳性。单引物与二重实时PCR两者阳性扩增符合率为100%。结论 对mecA、nuc基因进行二重实时PCR能准确、快速地鉴定耐甲氧西林的金葡菌和凝固酶阴性的葡萄球菌。
【关键词】 实时聚合酶链反应 耐甲氧西林金葡菌 mecA基因 nuc基因
Rapid detection of methicillin?resistant Staphylococcus aureus
ABSTRACT Objective To establish a duplex real?time polymerase chain reaction (PCR) assay for rapid detection of methicillin?resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Method A duplex SYBR Green real?time PCR assay targeting the mecA gene and a Staphylococcus aureus specific marker?nuc gene and identifying PCR products through melting curve analysis was used to rapidly identify MRSA. Results All MRSA strains tested in the study presented mecA and nuc gene specific peaks in the melting curve analysis; methicillin?susceptible Staphylococcus aureus (MSSA) strains only had a nuc peak, methicillin?resistant Staphylococcus epidermidis (MRSE) strains only had a mecA peak, and methicillin?susceptible Staphylococcus epidermidis (MSSE) strains and strains of species other than staphylococci had no peak. MRSA strains could be detected, by use of this duplex real?time PCR in an 102 cfu/ml inoculum. Positive rate of drug sensitivity test was 30.53% (40/131) among 131 S.aureus isolates tested, of which 29.01% (38/131) were positive for mecA gene and all were positive for nuc gene in the duplex real?time PCR. The agreement between simplex and duplex real?time PCR was 100% for positive results. Conclusion This study shows that the duplex real?time PCR assay with the primers for to mecA and nuc genes is a valuable tool for rapid and precise identification of MRSA and methicillin?resistant coagulase?negative staphylococci (MRCNS).
KEY WORDS Real?time polymerase chain reaction (RT?PCR); Methicillin?resistant Staphylococcus aureus (MRSA); mecA gene; nuc gene收稿日期：2006?06?15 修回日期：2006?10?30
金黄色葡萄球菌是引起和社区获得性感染的重要的人类病原菌，在整合了葡萄球菌盒式染色体mec元件(staphylococcal cassette chromosome mec element，SCCmec)并经历几次突变可演化成耐甲氧西林金葡菌(methicillin?resistant Staphylococcusaureus，MRSA)，导致包括万古霉素在内的几乎所有抗生素的失败［1］。因此，快速、准确地鉴定MRSA是控制院内感染的先决条件。
MRSA对甲氧西林耐药的机制主要是由青霉素结合蛋白PBP2a介导的，SCCmec中的mecA基因是PBP2a的编码基因［2］。金葡菌的胞外热稳定核酸酶的基因序列nuc具有种的特异性［3］。我们运用二重荧光实时聚合酶链反应(real?time polymerase chain reaction)检测金葡菌临床分离株的nuc基因和mecA基因，在进行菌种确认的同时快速鉴定MRSA。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)菌株来源 2005年9月从安徽省35所医院临床标本中无重复分离的131株金葡菌和6株凝固酶阴性的表葡菌；标准菌株金葡菌ATCC33591(MRSA)和金葡菌ATCC29213(MSSA)以及大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853等均由安徽医科大学附属医院感染病科提供。
(2)主要试剂 SYBR Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)购自TaKaRa公司，是一种二倍浓度的预混试剂(包含热启动DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq HS、反应用缓冲液、dNTP、SYBR Green I等)并附带参比染料ROX Reference Dye II(50×)；Mueller?Hinton琼脂(英国Oxoid公司)；头孢西丁钠(海南海药公司海口制药厂)。
(3)主要仪器 ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪(美国Applied Biosystems公司)，多点接种仪(英国AQS Manufacturing公司)。
(4)实时PCR引物 nuc基因的引物NUC1/NUC2，mecA基因的引物MECA1/MECA2分别扩增MRSA的279和222bp片段［3～5］。两种引物对均委托TaKaRa公司合成(表1)。
1.2 方法
(1)细菌培养与模板制备 将实验用菌种复苏后，分别划线接种到MH琼脂平板上，35℃培养24h后，挑取单个菌落溶于100μl灭菌蒸馏水中。菌悬液95℃水浴15min，7000r/min离心1min，弃沉淀、留上清液作为PCR反应的DNA模板。
表1 nuc、mecA二重实时PCR的引物序列
引物GenBank号序列(5′→3′)Tm(℃)NUC1V01281GCGATTGATGGTGATACGGTT55.9 (511→531)NUC2V01281AGCCAAGCCTTGACGAACTAA?60.4 AGC(766→789)MECA1X52593GCAATCGCTAAAGAACTAAG51.3 (693→712)MECA2X52593GGGACCAACATAACCTAATA51.3 (895→914)
(2)nuc或mecA基因单一引物实时PCR 25μl的反应体系中包含有12.5μl的SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、0.5μl的ROX Reference Dye II(50×)、2μl的DNA模板、上游和下游引物各0.2μmol/L。在ABI Prism 7500 PCR仪上经95℃、10s的模板预变性后，再进行40个循环的PCR扩增即95℃变性5s、60℃退火和延伸34s。最后一个循环的熔解程序为：95℃，15s；58℃，1min；95℃，15s。温度变化率除了从58℃升至95℃这一步为0.1℃/s，其余均为20℃/s。荧光信道设置在F1(530nm)处，单点荧光检测在每个循环的60℃、34s退火和延伸步骤。
(3)nuc、mecA基因二联引物实时PCR 反应总体积为25μl，包括：2×SYBR Premix Ex TaqTM 12.5μl，50×ROX Reference Dye II 0.5μl，DNA模板2μl，引物NUC1、NUC2各0.2μmol/L，引物MECA1、MECA2各1.0μmol/L。扩增程序与单一引物实时PCR相同。每次试验均包括阳性对照(MRSA标准菌株)和阴性对照(模板DNA由无菌水取代)。
(4)数据分析 反应结束后，确认SYBR Green I实时PCR扩增曲线和熔解曲线，结合CT(threshold cycle，阈循环)值、Tm(melting temperature，熔解温度)值判定结果。样本菌的扩增CT值≤35且荧光曲线呈对数增长；Tm值在MRSA标准株的Tm(mecA)±0.3℃范围之内的菌株被认为mecA基因阳性，Tm值在标准株的Tm(nuc)±0.5℃范围之内的菌株被认为nuc基因阳性。随机选取部分野生株的PCR产物进行3%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(5)特异性试验 用于检测该二重实时PCR体系特异性的相关菌株如前所述。
(6)灵敏度试验 MRSA标准菌纯培养增菌后，将上述增菌液各稀释成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等八个梯度。取一份稀释液用煮沸法提取核酸作为模板上荧光PCR仪；另取一份用来涂布三个平板，进行平板计数。
(7)抗生素敏感性试验 以ATCC29213为标准质控菌株，按照2005年美国临床实验室标准化研究所(CLSI)推荐的标准，采用琼脂平皿对倍稀释法测定头孢西丁对金葡菌的最低抑菌浓度(MIC)。结果判读标准［6］：头孢西丁的MIC≤8μg/ml为敏感，等于16μg/ml为中介，≥32μg/ml为耐药。
2 结果
2.1 nuc基因、mecA基因的检测
熔解曲线分析表明，所有金葡菌在nuc基因单一引物实时PCR中均呈现了Tm值在80.20～81.20℃之间特异性的峰；所有含mecA基因的菌株在mecA基因单一引物实时PCR中均呈现了该基因特异性的峰(Tm值，78.40～78.90℃)。
二重SYBR Green实时PCR的熔解曲线分析中所有MRSA菌株均呈现了两个峰，一个是mecA基因特异性的，另一个是nuc基因特异性的，Tm值范围同前；MSSA仅有一个nuc基因特异性的峰，MRSE仅出现mecA基因特异性的峰，MSSE没有任何特异性的峰出现，与阴性对照的结果相同(图1)。几株菌的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定片段大小与预期的一致。
2.2 二重实时PCR的特异性与敏感性
应用NUC1/NUC2、MECA1/MECA2两对引物检测大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853，结果显示非葡萄球菌菌株无任何特异扩增峰，而阳性对照出现了两个特异扩增峰。
将MRSA标准菌株的菌悬液配制成108，107，......，10cfu/ml浓度，提取DNA后进行二重实时PCR， 熔解曲线结果显示，mecA和nuc基因在菌浓
2.3 MRSA的鉴定
二重荧光实时PCR对131株临床金葡菌野生株的检测结果：nuc、mecA基因双阳性者为MRSA株，仅nuc基因阳性为MSSA株；mecA基因有38株阳性，阳性率为29.01%；nuc基因100%阳性。6株凝固酶阴性的表葡菌野生株nuc基因均为阴性，其中5株mecA基因单阳性者为MRSE，另1株双阴性者为MSSE。nuc/mecA基因单一引物实时PCR与二重荧光实时PCR的检测结果一致(表2)。
采用琼脂稀释法测定131株临床分离的金葡菌对头孢西丁的耐药性，其中耐药40株，中介3株，敏感88株，耐药率为30.53%(表2)。
表2 131株金葡菌二重实时PCR与头孢西丁MIC
结果比较(株数)
头孢西丁MIC(μg/ml)≥3216≤8合计mecA基因阳性361138阴性428793合计40388131
3 讨论
近年来，世界范围内MRSA感染率不断上升和其具有的多重耐药性，使之成为现有抗生素难以控制的感染菌。MRSA的mecA基因大量表达与β?内酰胺类抗生素有着极低亲和力的PBP2a，以替代高亲和力PBPs行使功能是其主要的耐药机制。mecA基因的表达某些辅助基因和调控基因的影响而导致异质性耐药(heterogeneity of resistance)。另外，中度耐药的金葡菌(moderately resistant S.aureus，MODSA)、边缘耐药的金葡菌(borderline oxacillin?resistant S.aureus，BORSAs)通过非mecA介导的途径也可表现出一定的低水平耐药［7］。因此，需要综合表型和基因型两方面的结果鉴定MRSA。
琼脂稀释法是CLSI/NCCLS推荐的检测MRSA的经典方法。葡萄球菌对头孢西丁耐药表明它对所有β?内酰胺类抗生素耐药［8］。我们测定了头孢西丁对131个金葡菌临床分离株的MIC，耐药率为30.53%。MIC法费力、耗时，成本较高，临床上不宜作为常规方法开展。目前，mecA基因的分子检测已取代了该法成为鉴定MRSA的“金标准”［7］。
传统遗传学方法基于MRSA的两个靶：金葡菌种特异性的基因和编码PBP2a的mecA基因；再结合PBP2a的免疫学检测被作为标准的MRSA确证试验［9］。但常规PCR操作复杂、耗时，后期操作有污染(如电泳、探针杂交、RFLP等来评价扩增产物)。荧光实时PCR在同一密闭的反应管中进行扩增和检测，无污染、速度快，灵敏度高、特异性强，是替代培养或免疫试验诊断感染性疾病的一个最佳选择［10］。
国外报道实时PCR检测MRSA所用产生荧光的化学方法有两种，一种是序列非特异性的，如DNA结合荧光团SYBR Green［5］；另一种使用了特异性荧光标记的探针，如杂交双探针［11］、核酸酶探针［12］、分子信标［13］。它们除了产生荧光信号的机制不同外，检测和分析的基本原理相似：即重复的PCR循环产生了以指数方式扩增的产物以及荧光强度上的一个相应的增加，荧光计监测报告荧光信号的全程变化并由软件分析结果。以PCR反应的前3～15个循环的荧光信号作为基线信号，荧光阈值定义为基线信号的标准偏差的10倍。扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数为阈循环(threshold cycle，CT)。模板DNA量越少，CT值越大；若CT值超出一定的范围时，即有可能产生污染，所以观察设定在35个循环内。SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。PCR反应完成后，当体系温度从58℃均匀升至95℃，PCR产物逐渐解链，检测的荧光值逐步下降。当温度接近Tm值时，双链DNA解链速度急剧变化，熔解曲线会在该温度出现一个相应波峰。DNA分子的Tm值通常与它的序列组成、GC含量、链长度有关，反应体系中的离子强度、SYBR Green I浓度等因素也会影响Tm值。根据熔解曲线波峰的多少和狭窄程度，峰顶对应的温度是否与预期Tm一致，确定产物的特异性。在二重实时PCR体系中，两种终产物具有不同的Tm值，分析同一反应物的荧光熔解曲线可区分nuc基因(Tm，80.20～81.20℃)和mecA基因(Tm，78.40～78.90℃)。该法的检测限为102cfu/ml，特异性试验未见有交叉反应。
本研究中131株临床金葡菌野生株29.01% mecA基因阳性，与药敏法结果(30.53%)近似。38株mecA阳性的金葡菌中药敏法耐甲氧西林的有36株，另有1株中介、1株敏感。后两者中所含mecA基因在多种内、外因素影响下有潜在表达的可能，应予重视，过程中应避免使用β?内酰胺类抗生素。吴本权等［14］研究发现不同温度、pH、盐浓度通过诱导耐药蛋白PBP2a的表达明显影响MRSA对苯唑西林、头孢唑林和头孢他啶耐药水平，而其mecA基因却不受培养条件的影响，可以快速检测MRSA感染。mecA基因阴性的金葡菌中有4株表现为耐药，2株中介，其原因可能为β?内酰胺酶的大量产生和其它PBPs与抗生素的亲和力降低。这些菌对大剂量β?内酰胺类抗生素或β?内酰胺类抗生素与β?内酰胺酶抑制剂的联合制剂仍然敏感，应避免糖肽类抗生素的滥用。郑波等［15］用常规多重PCR检测MRSA和MRCNS，也发现通过mecA基因的鉴别法与药敏法不是完全吻合，但有助于判断其耐药类型，为临床诊断和治疗提供依据。
从临床样本中直接检测MRSA是一个非常值得关注的课题。由于SCCmec元件在葡萄球菌属中分布广泛(如本次试验中鉴定的5株MRSE)，因此从临床标本中直接检测MRSA很困难。Fang等［5］组合肉汤增菌和SYBR Green实时PCR法建立了一种快速筛检临床样本中MRSA的程序，减少了剔除阴性结果的时间和精力，这对MRSA流行率低的国家(如北欧)来说特别有意义。实时PCR扩增MRSA中连接SSCmec和染色体插入位点间的序列，对于从临床样本的直接检测是很有希望的一个概念［13］。当然，这种方法需要额外的确认程序，并须考虑当地主要流行的MRSA型，且对于新现的SSCmec型仍无法识别［9］。
基于实时PCR中最简单实用的一种模式，我们建立了成本低、操作便捷、结果准确可靠的二重荧光实时PCR体系，适于常规微生物实验室对临床可疑的葡萄球菌分离株进行MRSA的快速鉴定。
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