三七丹参颗粒指纹特征研究
作者：张丽华 苑广信 赵丽丽 贾德伟
【摘要】 目的：建立三七丹参颗粒的HPLC定量和TLC定性指纹特征图谱。方法：用TLC法对三七丹参颗粒中的主要成分三七进行定性鉴别；用HPLC法测定三七丹参颗粒中丹酚酸B的含量。结果：TLC特征图谱能明显地检出三七；HPLC法测得本品中的特征图谱可确定丹酚酸B的含量。在0.02068μg～2.585μg的范围内，溶液的浓度与峰面积呈良好的线形关系，r=0.9999，平均回收率为98.47%（n=5），RSD为1.8%。结论：建立的指纹特征图谱能准确、快速地进行定性、定量检测，可用于该制剂的内在质量控制。
【关键词】 三七丹参颗粒 薄层鉴别 HPLC法 丹酚酸B
Study on Sanqi danshen granula by finger-print differentiation
【Abstract】Objective:to set up quantitative measure of SQDSG by HPLC method and qualitative specific fingerprint spectrum of TLC.method:to differentiate qualitatively the main gradients sanqi/danshen to SQDSG;to measure the content of danfensuanB by HPLC METHOD.Result:sanqi can be detected dramatically by TLC specific chromospectrum;content of danfensuanB can be determined by specific fingerprint spectrum woth HPLC method,and concentration of n conternt by HPLC method,shows a good linear relation with peak area,ranging form 0.02068μg～2.585μg,r is 0.9999,the average retrieve rate is 98.47(n=5),RSD is 1.8%.concusion:the characteristic fingerprint spectrum is a rapid and accurate method for quantitative and qualitative measurement for internal control of the preparation.
【Key words】sanqi danshen granula(SQDSG);single layer differentiation;HPLC method;danfensuanB
三七丹参颗粒是由三七、丹参等二味中药组成。具有活血化瘀、理气止痛。长期服用有预防和冠心病、心绞痛的作用[1]。原标准中的鉴别方法因以人参皂苷Rg1、Rb1作为对照品，专属性不强，且没有能够控制该药内在质量的定量指标。故本文在原标准的基础上增加了专属性强的三七皂苷R1的定性指标，采用高效液相色谱法对其制剂中的主要成分丹参中的丹酚酸B[2]进行了含量测定，获得了满意的HPLC定量和TLC定性指纹特征图谱，可有效地控制该产品的内在质量。其方法精密度高、重现性好，现报道如下。
1 实验材料
1.1 仪器
LC-2010A高效液相色谱仪，CLSAA-VP色谱工作站，UV-2401型紫外分光光度仪（日本岛津）。
1.2 试药、对照品与样品
硅胶G薄层板（青岛海洋化工厂）；人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1对照品（药品生物制品检定所，供鉴别用，批号分别为：0703-200221、110704-200318、0754-9905）；丹酚酸B对照品（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：111562-200403）；三七丹参颗粒（吉林省东方制药有限公司提供，批号：050501、050503、050507）；甲醇为色谱纯；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 三七TLC定性鉴别
取本品5g，研细，置50ml具塞锥形瓶中，加水数滴湿润，加入以水饱和的正丁醇15ml，密塞，振摇，放置2小时，分取正丁醇层（必要时离心取上清液），用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20ml，分取正丁醇层，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷对照品Rg1、Rb1、三七皂苷R1对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的混合溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2000年版一部附录VIB）试验，吸取上述两种溶液各2～4μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇︰醋酸乙酯︰水（4︰1︰5）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。而三七的阴性对照溶液在相应的位置上无干扰，结果见图1。
3 含量测定
3.1 色谱条件与系统适应性试验
色谱柱：DiamosilTM（钻石）C18（5μ 250×4.6mm）；流动相：乙腈-1%甲酸溶液（25︰75）；检测波长：286nm；流速：1.0ml/min；柱温：室温（25℃）；进样量：对照品溶液和样品溶液各10μl。理论板数按丹酚酸B峰应不低于3000。
3.2 溶液的制备
3.2.1 对照品溶液的制备
精密称取丹酚酸B对照品适量，加75%甲醇制成每1mL中含丹酚酸B40μg的溶液，即得。
3.2.2 供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品1g，研细，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失的重量，摇匀、滤过，取结滤液，即得。
3.2.3 阴性对照溶液的制备
取不含丹参的处方，按制备工艺制成缺丹参的阴性对照品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性对照品溶液。
3.2.4 干扰试验
分别精密吸取供试品溶液、阴性对照溶液、对照品溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图（图3），从图中可见，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，阴性液在此峰位无吸收，对本品中丹酚酸B含量测定无干扰，方法专属性强。
3.2.5 线性关系考察
精密吸取丹酚酸B对照品溶液（0.1034μg/ml）0.2、0.6、4、16、25μl分别注入液相色谱仪，依法测定，以进样量（μg）为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，得回归方程y=0.9471＋8.0599×10－5X，r=0.9999，线性范围0.02068～2.585μg。
3.2.6 精密度和稳定性试验
取样品（批号：050501）按“3.2.2供试品溶液的制备”方法制备样品溶液，重复进样5次，进样量10μl，其峰面积的相对标准偏差（RSD）为0.2%，表明精密度较好。
取对照品溶液，常温放置，每隔一定时间，按上述色谱条件测定一次，记录其峰面积积分值RSD为1.1%，结果表明丹酚酸B在36小时内基本稳定（n=6）。
3.2.7 重现性试验
取供试品（批号：050501），共5份，分别按“3.2.2供试品溶液的制备”方法制备样品溶液，依法独立测定5次，其丹酚酸B含量的RSD为2.0%，表明重现性较好。
3.2.8 回收率试验
精密称取已知含量（批号：050501，含量为1.9646mg/g）的样品适量，共5份，分别加入一定量丹酚酸B对照品，按“3.2.2供试品溶液的制备”方法操作，得回收率试验溶液，依法测定，结果见表1。表1 回收率试验结果（略）
3.2.9 样品的测定
分别取批号050501、050503、050507的3批样品，照供试品制备方法制备供试液，依法测定丹酚酸B的含量，色谱图见图3。结果3批样品中丹酚酸B的含量（mg/袋）分别为21.26、20.74、20.27。表2 样品含量测定（略）
4 讨论
4.1 本文在原标准的基础上增加了三七皂苷R1薄层指纹的定性指标，使制剂中三七的鉴别更具有专属性，且分离效果和重现性好。
4.2 采用HPLC法对其制剂中有效成分丹酚酸B进行定量检测，结果准确，方法简便，重现性及回收率均理想，指纹图谱峰稳定，可以有效地控制该产品的内在质量。
【】
[1] 程显隆．丹参中丹酚酸B的高效液相色谱法含量测定[J]．药物分析杂志，2003，2．
[2] 刘传贵．HPLC测定血栓心脉宁中丹酚酸B 的含量[J]．中药研究与信息，2005，12，7．
[3] 李玉珍．高效液相色谱法测定复方丹参片和滴丸中丹酚酸B和丹参酮ⅡA的含量[J]．药学杂志，2005，25，6．
[4] 李红磊．香丹注射液中丹酚酸B的含量的HPLC法测定[J]．分析测试学报，2005，11，24．
