冬虫夏草菌丝体发酵液中多糖的分离纯化与含量测定
【摘要】 ［目的］从冬虫夏草菌丝体发酵液中提取，分离虫草多糖，并建立样品中多糖的含量测定方法。［方法］采用D101大孔树脂分离冬虫夏草菌丝体发酵液中的多糖；采用苯酚-硫酸法测定样品中多糖含量。［结果］虫草多糖的得率为14?2g/L ；样品中虫草多糖的含量为70?6%。 ［结论］方法简便，准确，重现性好，可用于冬虫夏草菌丝体发酵液中虫草多糖的提取纯化和含量测定。
【关键词】 冬虫夏草菌丝体发酵液 多糖 大孔树脂 分离纯化 含量测定
Separation, Purification and Content Test of Polysaccharide in Zymotic Fluid of Cordycepts Mycelium
Abstract：［Objective］ To extract and separate polysaccharide from Cordyceps mycelium, and establish content test method of polysaccharide in sample. ［Method］ Take foramen magnum resin D101 to separate polysaccharide from the zymotic fluid of Cordyceps mycelium, the phenol-SO2 method to measure polysaccharide in sample. ［Result］ The receiving rate of polysaccharide was 14.2g/L; the content was 70.6% from sample. ［Conclusion］ The said method is simple, convenient, correct, can be used for separation, purification and content measurement of polysaccharide from the zymotic fluid of Cordyceps mycelium.
Key words：zymotic fluid of Cordyceps mycelium; polysaccharide; foramen magnum resin; separation and purification; content measurement
冬虫夏草(Cordyceps)为麦角菌科真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体，是高级滋补药品和名贵中药材。随着它的药用价值不断增大和药用范围的不断扩大，对虫草的需求量也在不断的增加。但是，由于天然虫草严格的寄生性及生长环境的特殊，且因人为因素的破坏，导致产量急剧下降，远远不能满足市场的需求。因此，从20世纪70年代起，人类就开始利用生物发酵技术培育虫草菌丝体［1］来代替天然虫草，但是，目前对虫草菌丝体发酵液的开发利用，国内外还是鲜有报道。大孔吸附树脂是20世纪60年代起来的新型精制方法［2］。它是一种不含交换基团，具有大孔结构的高分子材料。自从问世以来，已在环保、化工、医药等领域［3］得到广泛利用。本研究采用D101大孔吸附树脂从虫草菌丝体发酵液中分离虫草多糖，且用苯酚-硫酸法测定了样品中多糖的含量，结果表明：本方法操作简单，结果准确，重现性好，为进一步的研究开发提供了依据。
1 仪器、材料、试剂与样品
1?1 仪器与材料 TD5A?WS台式低速离心机（长沙湘仪离心机仪器有限公司）；754型紫外分光光度计（上海精密仪器有限公司）；D101大孔吸附树脂（天津制胶厂）。
1?2 试剂 D?葡糖糖(药品生物制品鉴定所，批号110833-200503)，乙醇，氯仿，正丁醇，苯酚，硫酸等（均为分析纯）。
1?3 样品 冬虫夏草菌丝体发酵液由浙江万丰集团制药有限公司提供。
2 方法与结果
2?1 虫草粗多糖的提取 取虫草菌丝体发酵液73?0mL，用80%乙醇沉淀3次，室温下放置24h，离心15min（3000r/min），弃去上清液，取沉淀物，减压干燥，得粗多糖21?9g。
2?2 虫草粗多糖纯化 取上述粗多糖21?9g，加水66mL溶解，取水溶液，采用sevag法［4］（1/5体积的氯仿，及1/5体积的正丁醇，剧烈震荡，静置分层后，过滤，取水层）去除蛋白质，操作3次后，将水层减压蒸干，用95%乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤粗多糖，减压干燥，得纯化粗多糖184g。
2?3 虫草多糖精制
2?3?1 树脂预处理［5］ 取市售D101大孔吸附树脂，用乙醇加热回流洗涤，至洗脱液蒸干后无残留物，反复洗脱保存备用。
2?3?2 装柱 以乙醇湿法装柱，用纯乙醇反复洗脱，至洗脱液与水混合不呈白色混浊为止（取1mL乙醇液加5mL水），再以蒸馏水洗脱至洗脱液无醇味，备用。
2?3?3 精制 将纯化的粗多糖溶解(上样量∶树脂量=1∶8~10)加到已处理好的D101大孔吸附树脂柱上，先用水洗脱至洗脱液无色，流速约为1mL/min，再用5倍量柱体积的30%乙醇、5倍量柱体积的50%乙醇洗脱，流速约为1mL/min，分别收集洗脱液。最后用95%乙醇洗脱至树脂无色，备用。斐林反应［6］表明：多糖主要集中在水洗脱部位，浓缩水洗脱液后得到精制多糖1?04g，得率为14?2g/L。
2?4 样品中虫草多糖的含量测定
2?4?1 对照品溶液的制备 取于105℃干燥至恒重的葡糖糖对照品250?0mg，精密称定，置500mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得0?5mg/mL的葡萄糖对照品溶液。
2?4?2 标准曲线的制备 精密量取对照溶液2?0ml、4?0ml、6?0ml、8?0ml、10?0ml于50ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。分别精密吸取以上对照品溶液1?0ml于10ml试管中，加5%苯酚［7］试液1?0ml，摇匀，迅速加浓硫酸5?0ml，振摇2min，置沸水浴中加热30min后，取出冷却至室温。另量取1?0ml蒸馏水按上述方法操作，作为空白对照。在490nm波长处分别测定吸光度，以吸光度值A为纵坐标，葡糖糖浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程为A=0?0077C－0?0002，r=0?9971
2?4?3 样品测定 取虫草多糖样品64?0mg，精密称定，置1000ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取样品溶液1?0ml，照标准曲线制备项下的方法，制备样品供试液，在490nm波长处测定样品吸光度（n=3），并样品中多糖含量，结果样品中多糖以葡糖糖计含量为70?6%。
3 讨论
本研究用的发酵液中含有单糖、二糖等成分，在选用醇沉条件的过程中，我们考察了三种乙醇浓度分别为65%、80%和95%进行沉淀，结果表明：用80%乙醇沉淀3次后，单糖、二糖等干扰成分能够去除最完全，而且对多糖含量不影响。蛋白质是在多糖沉淀中的主要杂质之一。根据报道［9］，目前去除方法有盐析法、等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、膜过滤法。本实验采用sevag法去除蛋白,和其他几种方法比较,具有操作简单、省时，并得到良好的效果。在考察上样量和树脂比例的过程中，我们结合比上柱量、比吸附量及比洗脱量等评价指标，进行了3个比例的比较，分别为1:5、1:10和1:15。结果表明：在上样量和树脂比例为1:10的时候，多糖的纯化效果最佳，树脂的使用效率最大。苯酚-硫酸比色法测定虫草多糖的原理是多糖在浓硫酸的作用下，先水解为单糖，迅速脱水形成糠醛衍生物，然后与苯酚缩合为有色化合物，在490nm处有特征吸收。本法简单，显色稳定，灵敏度高，重现性好。
【文献】
［1］ 徐方云.冬虫夏草及发酵虫草菌丝体的临床应用［J］.药品评价,2005,2(4):255.
［2］ 王继峰.大孔吸附树脂在分离提取中药有效成分中的应用［J］.湖南中医药导报,2001,7(3):125?126.
［3］ 侯世祥.影响大孔吸附树脂吸附纯化黄连提取液因素的初步考察［J］.中药杂志,2000,25(11):666?668.
［4］ STAUB A M.Methods in carbohydr.Chem［J］，1965,15(5):5?11.
［5］ 孙越,曹喜红,潘艳红,等.大孔吸附树脂在中草药研究中的应用［J］.中医药信息,2002,19(2):23.
［6］ 方晓明,姚燕,夏淑霞,等.黄精多糖的提取及含量测定［J］.时珍国药研究,1995,6(1):16.
［7］ 施亚琴,杨培全,周俊国,等.红毛五加多糖的提取及含量测定［J］.华西药学杂志,1994,9(2):73.
［8］ 张晓静,刘会东.植物多糖提取分离及药理作用的研究进展［J］.时珍国医国药,2003,14(8):495?496.
［9］ 欧阳臻,常钰,李永辉，等.桑叶多糖的提取纯化及其含量测定［J］.时珍国医国药,2005，16(10):962.
