水杨梅根提取物的体外抗肿瘤活性
作者：叶勇 涂先琴 宋兴文 施敏荣 江虹
【摘要】 ［目的］分离筛选水杨梅根中抗直肠癌细胞活性部位。［方法］采用系统溶剂法对水杨梅根水提取物进行分离，应用MTT比色法对分离得到的部位进行体外抗肿瘤活性的测定。［结果］乙酸乙酯提取物对直肠癌LS174T细胞表现出较强的抑制作用，在测定浓度范围内呈现出良好剂量依赖性抑制作用，而正丁醇和氯仿提取部位的抑制作用较弱。［结论］乙酸乙酯提取部位是水杨梅抗肿瘤主要的活性部位。
【关键词】 MTT法 水杨梅根 直肠癌
Abstract：［Objective］ To screen the anticancer fraction from extract of root of Adina rubella Hance.［Methods］To separate the water extract from root of Adina rubella Hance by different solvens，then determine their anticancer activities of the different extracts in vitro with MTT method.［Results］The ethylacetate extract strongly inhibited cell proliferation of LS174T,and showed significant dosage?dependent response while the butanol extract and the chloroform extract showed low anticancer activities in vitro.［Conclusion］The ethylacetate extract is the principal anticancer extract from root of Adina rubella Hance．
Key words：MTT；root of Adina rubella Hance；rectal cancer
中药水杨梅根为茜草科落叶灌木植物水杨梅Adina rubella(Sieb.et Zucc.)Hance的根，分布于我国江南及华南一带。临床表明它有抗消化道肿瘤的作用［1］，虽有报道自水杨梅根中分离出数种新化合物［2］，但有关其抗肿瘤活性报道甚少。本文以水杨梅根为实验材料，将其提取物对人直肠癌LS174T细胞进行处理，观察水杨梅根提取物对直肠癌细胞增殖的抑制作用，为水杨梅提取物抗肿瘤作用成分及其机理的研究提供依据。
1 实验材料
1?1 药材 水杨梅根购自浙江临安中药饮片厂，批号：20040710
1?2 细胞 人直肠癌LS174T细胞，广东中山大学医学院提供。在5％CO2，37℃条件下，用含10％小牛血清、青霉素(100μg／ml)，链霉素(100μg／ml)，RMPI1640培养液传代培养，实验用细胞均处于对数生长期。
1?3 药品与试剂 RPMI一1640培养基为Gibco公司产品；小牛血清为四季青公司产品；MTT和DMSO均为AM．RESCO公司产品，其余试剂均为分析纯。
2 方法
2?1 水杨梅有效成分提取与配制 干燥水杨梅根1kg，加入5000ml蒸馏水，90℃煎煮2h,过滤,滤渣再加3000ml蒸馏水继续90℃煎煮2h,过滤，将两次滤液合并后浓缩到1500ml。依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇提取。每次加入溶剂1/2体积萃取2次，各部分萃取液于旋转蒸发器上浓缩并回收溶剂，浓缩液挥干溶剂后称重，得率。所得的各提取物分别用二华南理工大学基金资助项目（322-E5041170）；学生研究计划SRP项目（B10-Y13014）甲基亚砜(DMSO)配成lg／ml，分装于4℃保存，临用时用培养液稀释成所需浓度，并使各组所含DMSO终浓度≤0.1％。
2?2 MTT法 采用方法［3］。直肠癌细胞以8×103个／孔的接种量接种于96孔培养板，5％CO2、37℃温箱中培养24h后，每孔加入不同浓度的药物各10μL使初步筛选的药物终浓度分别为103、102、10μg／ml，继续培养24h；而最终筛选的药物浓度分别为200、400、600、800μg/ml，继续培养48h后，分别加入50μL MTT温育4h，弃去培养基，加入150μL DMSO，在平板摇床上摇匀，在酶标仪495nm读板，根据测得的吸光度值按下式计算抑制率。按改良的Karber公式计算48h各提取部位的IC50值。抑制率=(1一实验组吸光度值／对照组吸光度值)×100％
2?3 统计学方法 组问比较和不同浓度条件下比较均采用齐性方差t检验。
3 结果
3?1 不同溶剂提取率 系统溶剂法分离提取部位各提取部位称重，得率(相对于总提物)，结果氯仿、乙酸乙酯、正丁醇部位的得率分别为0?096%，0?26%和1?29%。
3?2 各提取部位对人直肠癌LS174T细胞的增殖抑制作用24h水杨梅根对直肠癌细胞作用效果表明，在10~1000μg／ml浓度范围内，乙酸乙酯提取部位对人直肠癌LS174T细胞的增殖具有抑制作用；而氯仿和正丁醇提取部位的抑癌作用活性很低。通过延长各提取部位对人直肠癌LS174T细胞的作用时问及增加它们的实验浓度梯度，结果表明，不同浓度的各提取部位处理LS174T细胞，随浓度增加其抑制率也增加，在测定浓度范围内表现为剂量依赖性抑制。其中乙酸乙酯提取部位对人直肠癌LS174T细胞的增殖具有明显的抑制作用，而氯仿和正丁醇部位的抑癌作用不明显。结果见表1、2。
表1 水杨梅根提取物对LS174T作用24小时后各组OD值和抑制率(略)
与空白对照组相比，**P<0?01
表2 水杨梅根提取物对LS174T作用48小时后各组OD值和抑制率(略)
与空白对照组相比，*P<0?05，**P<0?01
3?3 各提取部位对人直肠癌LS174T细胞增殖抑制作用的比较 通过改良的Karber公式计算48h各提取部位的IC50值。乙酸乙酯提取部位的IC50为483?57μg/ml，而正丁醇、石油醚提取部位的IC50分别是890?26μg/ml和730?33μg/ml。比较各提取部位对人直肠癌LS174T细胞的IC50值，发现乙酸乙酯提取部位对人直肠癌LS174T细胞增殖抑制作用最强，正丁醇提取部位次之，氯仿提取部位抑癌作用则不明显。由此提示水杨梅抗直肠癌LS174T细胞的有效部位可能在乙酸乙酯及正丁醇部位，其中乙酸乙酯提取物是最主要的活性部位。
4 讨论
目前，直肠癌的主要手段是手术治疗和化疗。手术治疗对病人带来生活的不便和心理上的痛苦，化疗又存在较强的毒副作用。因此寻找既有较好疗效而又无明显毒副作用的中药，单独使用或联合化疗以提高疗效和减少毒副作用，是直肠癌防治的必然趋势。临床实验表明水杨梅根能抑制消化道肿瘤，为其成分研究提供了前提。本研究则揭示水杨梅根主要活性成分存在于乙酸乙酯提取物中，表明它可能是酚性化合物。因此下一步的研究将针对乙酸乙酯提取物作进一步分离，从而探明水杨梅根的抗肿瘤成分。
【】
［1］ 李郁仁.中医肿瘤学［M］.北京：技术出版社,1997：72?73.
［2］ 何直升,方世跃,胥传凤.水杨梅化学成分的研究［J］.中草药，1995，26(6):285?287.
［3］ 司徒镇强,吴军正.细胞培养［M］.西安：世界图书出版西安公司，2003：186?187.
