高效液相法测定不同产地柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量

【摘要】  　　［目的］建立一个HPLC方法，对国内13个不同产地柴胡样品中的柴胡皂苷a、d进行含量测定。［方法］色谱柱：YMC?Pack ODS?A C18(250×46mm，5μm)，流动相乙腈－水（43∶57），检测波长：203nm。［结果］柴胡皂苷a、d的线性回归方程分别为Ya=1?223×106X-2?2498×105(r=0?9999)、Yd=2?093×106X-4?7862×105(r=0?9998)，平均加样回收率分别为98?13%、97?99%。［结论］本研究建立的柴胡皂苷a、d含量测定方法简便易行，结果准确、可靠，便于对柴胡药材进行质量控制。

【关键词】  柴胡 柴胡皂苷a、d HPLC

　　Determination of Saikosaponin a，d of Radix Bupleuri from Different Areas by HPLC 

　　Abstract：［Objective］To develop a method using HPLC for determination content of saikosaponin a and saikosaponin d of Radix Bupleuri from different areas.［Method］Column：YMC?Pack ODS?A C18(250×46 mm，5μm)，mobile phase:acetonitrile?water(43∶57)，detected wavelength：203nm.［Results］The regression eguations of saikosaponin a and saikosaponin d were Ya =1?223×106 X - 2?249 8×105(r = 0?999 9)，Yd = 2?093×106 X - 4?786 2×105 (r = 0?999 8).The average recovery rates of saikosaponin a and saikosaponin d were 98?13 %，97?99 %.［Conclusion］The HPLC method is simply and suitable to control quantitative of radix bupleurum.

　　Key words：radix bupleurum；saikosaponin a,d; HPLC
   
　　柴胡为伞形科植物柴胡(Bupleurum Chinense DC.)或狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium Willd.)的干燥根，按性状不同，分别习称“南柴胡”及“北柴胡”。其主要成分为柴胡皂苷、挥发油及多糖类，具有疏散退热、舒肝、升阳的功效,主治感冒发热、疟疾、胸胀腹痛等症。柴胡皂苷是柴胡的主要有效成分之一，以柴胡皂苷a、d含量较高。可是，不同产地柴胡皂苷含量差异较大，《药典》2005年版一部，柴胡项下也未见柴胡皂苷a、d的含量测定。本文建立了HPLC法测定柴胡皂苷a、d的方法，并对不同产地的柴胡中柴胡皂苷a、d含量进行测定，为柴胡的质量评价提供更为可靠的依据。

　　1  仪器与试药

　　1?1  仪器  Varian Prostar系列高效液相色谱仪（230泵、330二极管阵列检测器、410自动进样器）；Sartorius Bs210s万分之一天平；Sartorius Bp211D十万分之一电子天平；HANNA PH201酸度计；KQ 3200DB超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；2K82?J真空干燥箱（上海实验仪器厂）；YXJ?2型离心机（常州电讯电器厂）；隔膜真空泵（津腾）；移液器。

　　1?2  试药  柴胡皂苷a对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：110777-200405），柴胡皂苷d对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：110778-200404），甲醇、乙腈、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氨水均为色谱纯或分析纯，纯水自制。柴胡药材（不同产地共13批），经杭州市药品检验所郭怡飚主任中药师鉴定。

　　2  方法与结果

　　2?1  色谱条件［1?2］  色谱柱为YMC?Pack ODS?A C18柱(250×46mm，5μm)；流动相为乙腈－水（43∶57）；流速：1?2mL/min；检测波长为203nm；柱温为室温。在此色谱条件下，柴胡药材中柴胡皂苷a、d的保留时间为6?26min、14?53min见色谱图1。

　　2?2  对照品溶液的制备  精密称取柴胡皂苷a对照品5?21mg，柴胡皂苷d对照品6?20mg，置25?0mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得，避光冷藏，备用。

　　2?3  供试品溶液的制备  精密称取柴胡药材粉末1?00g置锥形瓶中，加入100mL 5%氨水甲醇溶液，称重，70℃水浴加热回流4h，放冷，补足减失重量，溶液转移至离心管中，4000r/min离心10分钟，取上清液25mL，水浴挥干，残渣加适量甲醇溶解，并定容至5mL，过0?45μm滤膜，避光冷藏，备用。

　　2?4  标准曲线的制备  精密吸取标准溶液2、4、6、8、10μL，以峰面积积分值对进样量进行回归处理，得到回归方程a：Y=1?223×106X-2?2498×105(r=0?9999)表明柴胡皂苷a在（0?416μg～2?08μg）范围内线性关系良好，d：Y=2?093×106X-4?7862×105(r=0?9998)表明柴胡皂苷d在（0?496μg～2?48μg）范围内线性关系良好。    

　　图1  对照品（A）和样品（B）HPLC图(略)

　　Fig.1  HPLC Chromatograms of reference substance （A）and Fructus Aurantii （B）

　　2?5  精密度试验  精密吸取对照品溶液6μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，重复进样5次，结果柴胡皂苷a RSD为2?56%，柴胡皂苷d RSD为2?63%，表明本法精密度良好。

　　2?6  稳定性试验  取同一供试品溶液，分别在0h、1h、3h、6h、12h、18h、24h、48h、72h各进样10μL，测定峰面积，结果柴胡皂苷a RSD为1?11%，柴胡皂苷d RSD为0?95%，表明供试品溶液室温下放置72h基本稳定。

　　2?7  重复性试验  按供试品溶液制备方法平行制备6份，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，测定相应峰面积，测得柴胡皂苷a质量分数RSD为1?50%；柴胡皂苷d质量分数RSD为1?72%，表明本法重复性良好。

　　2?8  加样回收率试验：分别称取13号柴胡药材粗粉0?4g、0?5g、0?6g，各精密加入7?0、9?0、10?5ml对照品溶液，平行3份，按供试品溶液制备项下制备，并按上述色谱条件测定，回收率，结果柴胡皂苷a 的平均回收率为98?13 ％，RSD为2?31 %（n ＝ 9），柴胡皂苷d 平均回收率为97?99 ％，RSD为2?81 %（n ＝ 9）。

　　2?9  样品的测定  分别取不同产地的柴胡药材，按供试品溶液制备方法制备，分别精密吸取10μL，注入液相色谱仪，按外标法计算样品含量，结果见表1。色谱图见图1。

　　表1  不同产地柴胡药材中柴胡皂苷a、d含量测定结果(略)

　　Table 1  Comparison on the contents of saikosaponin a and saikosaponin d in Radixes Bupleuri from different producing areas

　　3  讨论

　　本方法提取测柴胡皂苷a、d简便快捷，分离度较好，方法学研究表明本方法稳定可靠，可以作为柴胡药材中柴胡皂苷a、d的含量测定方法。南柴胡和北柴胡药材中柴胡皂苷含量差异悬殊，以北柴胡中含量较高。相同品种柴胡因产地不同皂苷含量也有较大差异，含量高低相差十几倍至几十倍之多，以湖南、陕西、甘肃产的北柴胡和四川产的南柴胡含量较高。为保证药用柴胡的质量，急需在《药典》中规范柴胡药材中皂苷类成分的含量。

【】
  　　［1］ Zhang L，Wang Y.Determinalion the content of saikosaponin a in Zhengcaihu Yin by HPLC［J］.Chinese Traditional Patene Medicine (中成药)，2004，26(1)：79?80.

　　［2］ Lin D H,Mao R G,Wang Z H，et al.Quantitative analysis of saikosaponin a,c,d from 23 species of Radix Bupleuri in china by RP?HPLC［J］.Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis（药物分析杂志），2004，24（5）：479?483.