羧肽酶A1全酶及其肽段基因的克隆及分泌表达

【摘要】  目的： 克隆人羧肽酶A1（CPA1）全酶及其4条肽段基因，构建重组表达载体，并在COS?7细胞中分泌表达. 方法： 以胰腺总RNA为模板，RT?PCR扩增CPA1全酶基因；再以全酶基因为模板，PCR扩增其4条肽段基因；扩增产物分别克隆于分泌表达载体pFLAG?CMV?1中构建重组载体；然后用脂质体转染COS?7细胞，分泌表达融合FLAG?tag的目的蛋白和肽段；点印迹法检测目的蛋白的表达. 结果： 获得了CPA1全酶及其4条肽段基因，构建了重组表达载体，测序证实插入序列正确，并在COS?7细胞中成功分泌表达了融合FLAG?tag的目的蛋白和肽段. 结论： 在COS?7细胞成功分泌表达了融合FLAG?tag的CPA1全酶及其4条肽段，为下一步酶活性测定奠定了基础.

【关键词】  羧肽酶A1 肽类 COS?7细胞 分泌表达

    0引言

    抗体导向酶?前体药物疗法(antibody?directed enzyme prodrug therapy，ADEPT)中用于结肠癌的羧肽酶G2系统已进入临床实验［1-2］. 目前，构建抗体?酶融合蛋白及其应用已经成为研究热点［3］. 有研究［4-5］发现人羧肽酶A1（carboxypeptidase A1，CPA1）其分子量大，在临床试验研究操作中存在一定困难. 已克隆并表达的CPA1活性中心仅有全酶的一半分子量，虽然此活性中心分子量较小，但存在活性较低的问题. 我们通过在活性中心两侧扩展片段的方法来提高酶活性，克隆并分泌表达了CPA1全酶及其包括活性中心在内的的4条肽段，为下一步酶活性测定并筛选出活性高而分子量低的酶片段奠定基础.

    1材料和方法

    1.1材料COS?7细胞，E.coli DH5α为西京检验科临床分子生物学实验室保存；真核细胞分泌表达载体pFLAG?CMV?1由第四军医大学遗传与发育生物学教研室韩骅教授惠赠；逆转录试剂盒(Primescript 1st Strand cDNA Synthesis Kit)，Taq DNA聚合酶，T4 DNA连接酶，HindⅢ/BamHⅠ限制性内切酶，DNA Marker（大连Takara公司）；小量质粒提取和胶回收试剂盒（上海Watson公司）；去内毒素质粒中提试剂盒（美国Promega公司）；脂质体Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；Rabbit Anti FLAG?tag抗体（南京Genscript公司）；辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体（上海碧云天公司）；DMEM干粉培养基（美国Gibco公司）；化学发光底物试剂盒（美国Pierce公司）. 其余均为国产分析纯试剂.

    1.2方法

    1.2.1引物设计根据已报道的CPA1 cDNA（GenBank Accession No.NM?001868）序列设计3条正义链引物和2条反义链引物. 正义链引物：P1：5′?GCGAAGCTTAAGGAGGACTTTGTGG?3′；P3：5′?CGAA

    AGCTTATCGACACGGGCATCCAT?3′；P5：5′?TTTAAGCTTCCGCACCTTGTCAGCAAG?3′；反义链引物：P2：5′?GTTGGATCCTCAGTAGGGGTGATTCAG?3′；P4：5′?TTTGGATCCTTAGTCCCGGAGCTCGAA?3′.

    引物由大连Takara生物工程公司合成，其中正义链引物5′端引入HindⅢ酶切位点，反义链引物5′端引入BamHⅠ酶切位点和终止密码. P1/P2扩增序列为全酶基因，长1209 bp，记为cpa1，翻译后产物记为CPA1；P3/P4扩增序列为活性中心基因，长630 bp，记为a，翻译后产物记为肽段A；P5/P4扩增序列为活性中心基因与其上游102 bp碱基，长732 bp,记为b，翻译后产物记为肽段B；P3/P2扩增序列为活性中心基因与其下游108 bp碱基，长738 bp，记为c，翻译后产物记为肽段C；P5/P2扩增序列为活性中心基因与其上游102 bp碱基及下游108 bp碱基，长840 bp，记为d，翻译后产物记为肽段D.

    1.2.2PCR扩增基因取实验室冻存正常胰腺组织总RNA，按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，得到胰腺组织cDNA；以逆转录产物为模板，P1/P2引物PCR扩增CPA1全酶基因；再以全酶基因为模板，相应引物PCR扩增CPA1的4条肽段基因. PCR反应体系与Taq DNA聚合酶说明书50 μL体系相同，反应条件：95℃ 5 min后，95℃变性1 min，57℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min，经过30个循环，最后72℃延伸5 min. PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.

    1.2.3构建重组表达载体用HindⅢ和BamHⅠ双酶切纯化的PCR产物和表达载体pFLAG?CMV?1，30℃，2 h；酶切产物经电泳、胶回收后用T4 DNA连接酶4℃过夜连接，得到的重组表达载体转化DH5α感受态细胞，用含0.1 g/L氨苄青霉素的LB平板进行筛选.

    1.2.4双酶切鉴定重组质粒抗性筛选得到的阳性克隆增菌后提取质粒，HindⅢ和BamHⅠ双酶切重组质粒，酶切产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果.

    1.2.5重组质粒序列测定质粒双酶切阳性的克隆菌送北京奥科生物工程公司进行序列测定. 经序列分析后，所得正确重组表达质粒分别命名为pFLAG?CMV1?cpa1，pFLAG?CMV1?a，pFLAG?CMV1?b，pFLAG?CMV1?c和pFLAG?CMV1?d.

    1.2.6转染COS?7细胞用去内毒素质粒中提试剂盒制备高纯度重组表达质粒，紫外分光光度计测定DNA浓度. 96孔板接种COS?7细胞，DMEM培养液，37℃，50 mL/L CO2条件下进行培养，待细胞密度至90%时，按Lipofectamine 2000试剂盒说明书转染各重组质粒，并设转染空质粒（pFLAG?CMV?1）和未转染质粒细胞为阴性对照.

    1.2.7点印迹法检测表达产物转染细胞培养6 h换液后，继续培养18 h，取细胞培养上清液，以转染空载体细胞和未转染细胞培养上清为空白对照. 在甲醇浸透的PVDF膜上点样5 μL；待膜干燥后，室温下50 g/L牛血清白蛋白封闭1 h；1∶1000稀释一抗孵育30 min，TBS?T漂洗3次,每次5 min；再与1∶5000稀释二抗孵育30 min，TBS?T漂洗3次,每次5 min，TBS漂洗1次,5 min；最后与化学发光底物反应5 min后在暗室压片显影.

    2结果

    2.1CPA1及其肽段基因扩增扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳后，分别在约1200，600，700，700和800 bp处出现特异条带，与预期结果大小相符，相应为基因cpa1，a，b，c和d（图1）.

    AM: DNA marker; 1: CPA1基因 RT?PCR扩增产物. BM: DNA marker; 1: a基因 PCR扩增产物; 2: b基因PCR扩增产物; 3: c基因PCR扩增产物; 4: d基因 PCR扩增产物.

    图1CPA1及其4条肽段基因扩增产物电泳结果

    2.2重组质粒的双酶切鉴定重组质粒酶切后经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别在约1200，600，700，700和800 bp处出现特异条带，出现与预期结果一致，空质粒无酶切片段（图2）. 说明质粒中有相应目的基因片段插入.

    M: DNA marker; 1: pFLAG?CMV1?cpa1; 2: pFLAG?CMV1?a; 3: pFLAG?CMV1?b; 4: pFLAG?CMV1?c; 5: pFLAG?CMV1?d; 6: pFLAG?CMV?1.

    图2重组质粒HindⅢ/BamHⅠ双酶切鉴定结果

    2.3重组质粒测序序列测定结果证实重组质粒中插入的基因片段为cpa1，a，b，c和d. 序列分析结果显示，全酶基因与已知序列相比有3处碱基不同，分别为第481位T→C转换；第607位T→C转换；第1024位C→T转换，但其编码的氨基酸没发生改变，CPA1各肽段基因突变位置与全酶相同.

    2.4点印迹检测表达产物细胞培养上清中融合了FLAG?tag的CPA1全酶及其4条肽段的分泌表达，转染空质粒组因有FLAG?tag表达呈阳性结果，未转染质粒组则呈阴性（图３）.

    1: CPA1; 2: 肽段A; 3: 肽段B; 4: 肽段C; 5: 肽段D; 6: FLAG?tag; 7: 对照.

    图3表达产物检测结果

    3讨论

    ADEPT是近年来起来的颇具应用前景的肿瘤导向新途径，该方法利用针对肿瘤抗原的特异性抗体作为载体，携带前体药物的专一性活化酶，使前药可以区域特异性地在肿瘤组织内被抗体所携带的酶转化为活性细胞毒分子，发挥对肿瘤细胞的杀伤作用. 研究中我们发现将其运用于临床还存在一些问题. 这是由于CPA1分子量较大，造成抗体?酶交联物不易进入实体瘤，酶在肿瘤部位水解前药效率低，不易形成有效的药物浓度杀伤肿瘤. 另外，如要制备酶?抗体融合蛋白，也由于CPA1分子量大，融合基因的表达存在困难，较难获得有活性且具备一定量的融合蛋白［6］. 因此，找到分子量较小但活性较强的最佳水解酶是解决以上问题的途径之一. 为此，本实验室前期实验根据研究［7］报道的机模拟设计，分别利用大肠杆菌和毕赤酵母表达了只有CPA1全酶一半分子量的CPA1活性中心［4-5］，后者分子量相对较小，有水解活性，但活性较低，约为全酶一半左右，不能完全满足后续实验研究的需求. CPA1活性中心的成功表达，为寻找具有CPA1酶活性的肽段的想法提供了依据.

    本研究中使用的表达载体pFLAG?CMV?1，是哺乳动物细胞分泌表达载体，具有以下优点：① 在哺乳动物细胞表达，易于得到有活性的目的蛋白；② 有胰蛋白酶信号肽基因，尤其适合在COS细胞系瞬时性高分泌表达目的基因；③ 表达的目的蛋白氨基端融合了FLAG?tag（6肽），此标签方便了表达产物的检测.

    综上所述，我们成功克隆了CPA1全酶及其4条肽段基因，构建了重组表达载体，转染COS?7细胞后，用点印迹法在转染细胞培养上清液中检测到了融合FLAG?tag的目的蛋白和肽段，证明分泌表达CPA1全酶及其4条肽段是可行的，为下一步酶活性测定奠定了基础.

【】
  ［1］ Francis RJ, Sharma SK, Springer C, et al. A phase I trial of antibody directed enzyme prodrug therapy(ADEPT) in patients with advanced colorectal carcinoma or other CEA producing tumours［J］. Br J Cancer, 2002,87:600-607.

［2］ Mayer A, Francis RJ, Sharma SK, et al. A phase I study of single administration of antibody?directed enzyme prodrug therapy with the recombinant anti?carcinoembryonic antigen antibody?enzyme fusion protein MFECP1 and a bis?iodo phenol mustard prodrug［J］. Clin Cancer Res, 2006,12:6509-6516.

［3］ Coelho V, Dernedde J, Petrausch U, et al. Design, construction, and in vitro analysis of A33scFv: CDy, a recombinant fusion protein for antibody?directed enzyme prodrug therapy in colon cancer［J］. Int J Oncol, 2007,31:951-957.

［4］ 岳乔红,苏明权,杨柳,等. 羧肽酶A1及其活性中心基因的表达及活性分析［J］.肿瘤生物治疗杂志, 2005,12(3):206-210.

［5］ 易静,郝晓柯,苏明权,等. 人羧肽酶A1活性中心的毕赤酵母可溶表达［J］. 第四军医大学学报, 2006, 27(5): 389-391.

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［7］ Wei S, Segura S, Vendrell J, et al. Identification and characterization of three members of the human metallocarboxypeptidase gene family［J］. J Biol Chem, 2002,277:14954-14964.