脂多糖对大鼠下丘脑室旁核GABABR1阳性神经元的激活作用

【摘要】  目的： 探讨大鼠下丘脑室旁核(PVN)?氨基丁酸B受体亚单位1(GABABR1)阳性神经元对脂多糖(LPS)刺激的反应. 方法： 将大鼠腹腔注射LPS建立免疫应激模型，对照组注射等量的生理盐水,采用免疫荧光双标记与激光共聚焦显微镜技术，观察大鼠下丘脑室旁核内神经元Fos和GABABR1的标记情况以及它们在同一神经元内是否有共标记. 结果： 腹腔注射LPS可使大鼠PVN内表达Fos神经元数量显著增高,且PVN内部分神经元可同时被Fos和GABABR1双重标记，双重标记的神经元大约占Fos神经元的30%，占GABABR1的24%. 结论： 下丘脑室旁核部分GABABR1阳性神经元参与了LPS诱导的免疫应激反应，它们可能在下丘脑?垂体?肾上腺轴的调节方面起重要作用.

【关键词】  脂多糖类 基因 Fos γ?氨基丁酸B受体亚单位1(GABABR1) 荧光抗体技术 下丘脑室旁核(PVN) 应激

    0引言

    脂多糖(LPS)进入机体能够诱导免疫细胞分泌炎性细胞因子，激发机体的免疫应激反应，动物注射LPS是研究免疫系统和神经系统之间关系的常用模型［1］. γ?氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，通过离子型受体GABAAR和代谢型受体GABABR发挥作用［2-3］. GABABR包括GABABR1和GABABR2两个亚型，其中GABABR1是受体的主要部分［2］. 下丘脑是人体神经内分泌及自主神经系统的整合中枢，室旁核（PVN）是下丘脑内的重要核团，它通过下丘脑?垂体?肾上腺轴等途径参与各种应激反应的调节［4］. 以往的研究［5-6］表明，在下丘脑PVN内有表达GABABR1的神经元. 另一方面，LPS刺激可引起PVN神经元表达Fos［7-8］，说明PVN神经元参与由LPS激发的免疫应激反应的调节,但LPS是否激活PVN内GABABR1阳性神经元尚缺乏直接的证据，我们对此进行研究以阐明GABA及其受体在下丘脑对免疫应激反应的影响.

    1材料和方法

    1.1材料健康成年SD雄性大鼠12只,体质量200～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供. 兔抗Fos抗体(Sigma公司)；豚鼠抗GABABR1抗体,得克萨斯红结合的羊抗兔IgG,异硫氰酸荧光素（FITC）结合的驴抗豚鼠IgG(Chemicon公司)；Leica 1800恒冷箱切片机（德国莱卡公司）； FV1000激光共聚焦显微镜（日本Olympus公司）.

    1.2方法

    1.2.1动物模型的建立及切片制备动物购入后置于安静、温暖(25℃左右)、避强光和自由摄食的环境中饲养48 h，避免非特异性应激反应的发生. 将动物随机分为实验组（6只）和对照组（6只）. 于8∶00点在大鼠清醒状态下,对实验组大鼠迅速腹腔注射300 μL生理盐水溶解的LPS，250 g/kg；对照组注射等剂量的生理盐水. 两组动物在上述相同环境中放置3 h后，用过量10 g/L戊巴比妥钠(>40 mg/kg)深度麻醉，迅速开胸经左心室至升主动脉插管，先以100 mL生理盐水洗去血液，继用含40 g/L多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.4，4℃)先快后慢灌流固定，取出全脑置于相同的灌注液中后固定4～6 h，然后将材料移至含300 g/L蔗糖的PB内，4℃保存直至组织沉底. 恒冷箱切片机切制含PVN［9］的间脑连续冠状切片，片厚30 m，切片共分5套，分别用于Fos，GABABR1单标记和双标记以及对照，另一套做备用. 切片收集于盛有0.01 mol/L PBS的网格内，PBS洗3次×10 min，待用.

    1.2.2免疫荧光双标记染色将兔抗Fos抗体(1∶500)和豚鼠抗GABABR1抗体(1∶1000)用含10 g/L小牛血清白蛋白和1 g/L Triton X?100的0.01 mol/L PBS混合后常温孵育切片24 h，用0.01 mol/L PBS洗3次×10 min,然后用得克萨斯红交联的羊抗兔IgG(1∶500)和FITC交联的驴抗豚鼠IgG(1∶500)混合液常温孵育切片2 h，用0.01 mol/L PBS洗3次×10 min,将组织切片贴于载玻片上,凉干,用含500 g/L甘油的0.01 mol/L PBS封片. 单标记过程同上，抗体用相应的组套. 在激光共聚焦显微镜下观察并采集图像.

    1.2.3对照实验除一抗用正常的血清白蛋白代替外，其他程序与上述过程相同，正常血清孵育的组织片上检测不到Fos和GABABR1免疫阳性神经元.

    统计学处理：每只大鼠在含PVN前、中、后平面上各选取3张切片，计数单标记和双标记的神经元数量,取每组6只的平均值. 结果以x±s表示,用SPSS13.0对组间差别进行t检验，P<0.05表示有统计意义.

    2结果

    2.1GABABR1在下丘脑室旁核的标记GABABR1阳性产物见于神经元胞膜和胞质内，标记的神经元发出明亮的绿色荧光，细胞轮廓清楚，胞核未染，细胞形态多呈圆形，突起不明显（图1A,B）. 阳性神经元较多地分布在下丘脑PVN外侧大细胞部，并向内延续到小细胞部及腹侧部，但数量逐渐减少、染色强度逐渐减弱. 虽然LPS组的GABABR1阳性神经元数较对照组稍多、有些神经元染色较重，但两组之间的差异无统计学意义（图2）.

    2.2Fos在下丘脑室旁核的标记Fos阳性神经元发出明亮的红色荧光，阳性产物限于胞核内，胞核深染、圆形，边缘光滑，胞质未染色，因而树突、胞体未显示. 对照组大鼠Fos仅有零星散在分布（图1C）. LPS组Fos阳性神经元主要见于下丘脑PVN内侧小细胞部和腹侧部，在外侧大细胞部也有少量分布（图1D）；LPS实验组的Fos阳性神经元数量显著增多，常是对照组的数倍，两组比较差异显著(P<0.01，图2).

    2.3Fos/GABABR1双标神经元在下丘脑室旁核的标记在Fos和GABABR1双标记的切片中可以看到3种类型的标记细胞：发出明亮红色荧光的Fos神经元、发出明亮绿色荧光的GABABR1神经元和Fos/GABABR1 双标记神经元. 双标的特点为在同一神经元内，胞质为GABABR1阳性发出的绿色荧光，胞核为Fos阳性发出明亮的红色荧光（图1E~G）. 在LPS组，Fos/GABABR1双标神经元主要分布于下丘脑PVN的外侧大细胞部与小细胞部交界处以及PVN腹侧部. Fos/GABABR1双标细胞数量分别约占Fos和GABABR1单标细胞数量的30%和24%. 对照组少见双标细胞，无分布（图1E）. 两组大鼠下丘脑室旁核各种类型标记细胞计数结果见图2.

    3讨论

    在LPS刺激引起的应激反应中，神经、内分泌和免疫系统三者之间相互作用、相互影响，最终达到恢复维持机体内环境的稳定. 在此反应过程中，下丘脑?垂体?肾上腺轴起关键作用［10-11］. 以往的研究［10］指出，全身或中枢急性注射LPS可以增加下丘脑PVN内肾上腺素释放激素(CRF) mRNA及CRF的水平，而损毁下丘脑后则不会发生此种情况，因此认为LPS可激活下丘脑?垂体?肾上腺轴，并认为激活的起始点在PVN. 在本实验中，我们发现腹腔注射LPS后，PVN内有大量的表达Fos的神经元，阳性神经元主要分布在内侧小细胞部和腹侧部，进一步证实LPS对下丘脑的激活作用. 这个结果与以往的研究结果基本一致［7-8］. LPS对下丘脑神经元激活的途径目前还不完全清楚，可能是通过刺激巨嗜细胞分泌细胞因子，如TNF?α，IL?1，IL?6等对PVN神经元直接作用［10,12］，或者是通过外周内脏感觉神经系统传导到延髓内脏带，再传导至PVN而发挥作用［10,13］.

    A，C，E: 生理盐水对照组； B，D，F，G: LPS实验组. 图G为一双标记高倍放大图，箭指示双标细胞，分叉箭指示Fos阳性，三角箭头指示GABABR1阳性细胞. 标尺：A~F=50 μm； G=20 μm.

    图1共聚焦免疫荧光显微照片显示大鼠下丘脑室旁核内GABABR1(A,B), Fos(C,D)和Fos/GABABR1(E,F,G)双标细胞的分布

    bP<0.01 vs 对照组.

    图2两组Fos，GABABR1和Fos/GABABR1阳性神经元在PVN每张切片上的平均数量对比

    形态学研究表明PVN内有大量的GABA神经终末，这些GABA能纤维可能来源于下丘脑局部或终纹床核等［14］. 近来的研究还指出PVN内既有GABAAR，也有GABABR［5-6］. 生和形态学实验还显示两类受体都存在于PVN的CRF神经元或分泌加压素(VP) 神经元上［5-6,15 ］. 而此两种神经元在下丘脑?垂体?肾上腺轴对LPS诱导的免疫应激反应中又起重要作用［10-11］. 但以往没有直接证据说明PVN内表达两种受体的神经元直接参与了LPS诱导的免疫应激反应. 本实验中，我们给动物腹腔注射LPS，在下丘脑PVN内观察到许多既是Fos阳性、又表达GABABR1的神经元，首次证明了GABABR1参与了由LPS的诱导的免疫应激反应. 我们最近的实验也证明了GABAAR1也参与了这个反应［16］. GABA受体阳性神经元参与免疫应激反应的意义可能在于，这些神经元通过接受机体的应激信息而激活，从而抑制丘脑?垂体?肾上腺轴的过度兴奋，减轻机体对LPS刺激的过强反应, 维持机体内环境的稳定，起到了机体保护作用. 其中GABABR1属于代谢性受体，可能较GABAAR在此过程中发挥更加持久的作用.

    虽然GABABR1阳性神经元与Fos阳性神经元的分布区域主要在内侧小细胞部与外侧大细胞部延续处重叠，并有一定数量的双标记细胞，但两者的主要分布上存在一定的差别，Fos阳性神经元主要密集分布于PVN内侧小细胞部，而GABABR1阳性神经元更多地分布在外侧大细胞部，说明参与LPS刺激所致的急性应激反应的神经元还有很大部分不含GABABR1，这些神经元所含的受体，还有待进一步研究.

【】
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